RRBS揭示基于DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因的腎透明細(xì)胞癌預(yù)后模型的鑒定

腎細(xì)胞癌（RCC）是最常見的腎癌亞型，每年超400萬例新發(fā)病例，是泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤導(dǎo)致的第二大死因。2%-70%的RCC為透明細(xì)胞RCC（Clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）。DNA甲基化（DNA methylation，DNAm）是主要的表觀遺傳修飾之一，在維持基因轉(zhuǎn)錄和基因組穩(wěn)定性方面具有至關(guān)重要的作用。DNAm在ccRCC的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，許多研究集中于DNAm異常變化與ccRCC預(yù)后之間的相關(guān)性，但基于DNAm驅(qū)動(dòng)基因的ccRCC預(yù)后模型鮮有報(bào)道。
 
2023年6月7日，南方醫(yī)科大學(xué)附屬龍華人民醫(yī)院泌尿外科鄧瓊研究員等在《BMC Genomics》發(fā)表題為“Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma“的研究論文，該研究以ccRCC患者的DNA為對(duì)象，通過簡化基因組重亞硫酸鹽測序（RRBS）等技術(shù)方法，鑒定出ccRCC患者的ccRCC早期診斷和預(yù)后的DNA甲基化生物標(biāo)志物。
標(biāo)題：Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma（基于DNA甲基化驅(qū)動(dòng)基因的腎透明細(xì)胞癌預(yù)后模型的鑒定和驗(yàn)證）
時(shí)間：2023-06-07
期刊：BMC Genomics
影響因子：IF 4.4
技術(shù)平臺(tái)：RRBS等

摘要：
腎透明細(xì)胞癌（ccRCC）是一種形態(tài)異質(zhì)且預(yù)后不良的惡性腫瘤。本研究旨在建立DNA甲基化（DNAm）驅(qū)動(dòng)的ccRCC基因預(yù)后模型。本研究對(duì)ccRCC患者的DNA提取物進(jìn)行了RRBS測序分析。對(duì)10對(duì)患者樣本的RRBS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析以篩選候選CpG位點(diǎn)，然后訓(xùn)練并驗(yàn)證18個(gè)CpG位點(diǎn)模型，并結(jié)合臨床特征建立了用于ccRCC預(yù)后或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的列線圖（Nomogram model）模型。研究在啟動(dòng)子區(qū)域鑒定出2261個(gè)DMR。經(jīng)DMR篩選后，共篩選出578個(gè)候選基因，與450K芯片中的408個(gè)CpG二核苷酸相對(duì)應(yīng)。從TCGA數(shù)據(jù)集中收集了478個(gè)ccRCC樣本的DNAm圖譜。通過單因素Cox回歸、LASSO回歸和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析對(duì)319個(gè)樣本的training集進(jìn)行分析，共鑒定出18個(gè)CpG的預(yù)后組。結(jié)合臨床特征構(gòu)建了預(yù)后模型，在測試集（test set，159個(gè)樣本）和整組（whole set，478個(gè)樣本）中，Kaplan-Meier曲線差異顯著；ROC曲線和生存分析顯示AUC＞0.7。結(jié)合臨床病理特征和甲基化風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的列線圖表現(xiàn)較好，決策曲線分析也顯示出有益的效果。
本研究深入了解了高甲基化在ccRCC中的作用。鑒定出的靶標(biāo)可作為ccRCC早期診斷和預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。本研究對(duì)更好的風(fēng)險(xiǎn)分層和個(gè)性化治療具有重要意義。
 
研究結(jié)果
（1）RRBS質(zhì)控結(jié)果
表3：C和CpG位點(diǎn)甲基化和比對(duì)

表4：CG、CHG、CHH平均甲基化水平（>1X深度）

圖1：樣本間全基因組甲基化差異。

1. 樣本中CpG甲基化水平相關(guān)性。較大的圓形區(qū)域和較深的顏色表示高相關(guān)性。
2. 聚類樹狀圖。根據(jù)歐幾里得距離，使用R.Ward.d2的hclust函數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行聚類。選擇最小方差方法作為聚類方法

（2）DMR鑒定
圖2：DMR分析

1. 平均甲基化差異。X軸代表甲基化差異。負(fù)值表示低甲基化。正值表示高甲基化。Y軸表示相應(yīng)橫坐標(biāo)的DMR數(shù)量。
2. DMR甲基化分布密度。X軸代表Ca組中的DMR甲基化水平；Y軸代表對(duì)照組中的DMR甲基化水平。DMR密度從低到高（白色到紅色）。
3. DMR在基因元件上的分布

 
（3）ccRCC預(yù)后模型構(gòu)建
圖3：差異甲基化CpG（differentially methylated CpG，dmCpG）位點(diǎn)鑒定。
A、 使用調(diào)諧參數(shù)（lambda）對(duì)CpG位點(diǎn)進(jìn)行LASSO回歸分析。
B、 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作。
C、 18個(gè)dmCpG位點(diǎn)的DisGeNet疾病富集分析。
D、 18個(gè)dmCpG位點(diǎn)的GO富集分析
 

表5：預(yù)后模型中18個(gè)CpG位點(diǎn)的注釋
 

（4）預(yù)后模型的Training

圖4：training集中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分

1. 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的KM生存曲線。數(shù)據(jù)顯示為四分位間距的中位數(shù)。使用Log-rank檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。虛線顯示50%生存概率的顯著性。
2. 計(jì)算高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和生存狀態(tài)等級(jí)。虛線顯示區(qū)分ccRCC高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)患者的臨界值。
3. C.18個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平熱圖。
4. 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的1年、3年、5年和10年ROC曲線。以臨界值決定該模型的敏感性和特異性

 
圖5：test集中的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分
 

（5）預(yù)后模型的驗(yàn)證
圖6：基于預(yù)后模型和臨床特征的列線圖
預(yù)后模型和臨床特征的單因素（A）和多因素（B）回歸分析。（C）預(yù)測ccRCC患者1年、3年、5年和10年生存時(shí)間概率列線圖
 


圖7：模型校準(zhǔn)和ROC評(píng)估

1. 高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組患者的KM生存曲線。
2. 預(yù)測ccRCC患者1年、3年、5年和10年總生存期（OS）的列線圖。

C-F.  1年（C）、3年（D）、5年（E）、10年（F）的臨床病理特征（綠色，與腫瘤分期診斷、年齡和腫瘤組織學(xué)分級(jí)相結(jié)合），RiskScore（紅色）和NomoScore（黑色）的ROC曲線
 
結(jié)論
本研究分析了患者樣本中的RRBS數(shù)據(jù)以篩選原始候選CpG位點(diǎn)，然后利用TCGA-KIRC數(shù)據(jù)訓(xùn)練和驗(yàn)證了18個(gè)CpG位點(diǎn)模型，并結(jié)合臨床特征建立了用于ccRCC預(yù)后或風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的列線圖模型。
基于該結(jié)果，研究開發(fā)并驗(yàn)證了這種新型預(yù)后模型是一種實(shí)用、可靠的ccRCC患者預(yù)后工具。本研究結(jié)果支持異常DNAm變化與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的觀點(diǎn)，并為ccRCC提供了潛在的新型預(yù)后生物標(biāo)志物，對(duì)更好的風(fēng)險(xiǎn)分層和個(gè)性化治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：
Deng Q, Du Y, Wang Z, Chen Y, Wang J, Liang H, Zhang D. Identification and validation of a DNA methylation-driven gene-based prognostic model for clear cell renal cell carcinoma. BMC Genomics. 2023 Jun 7;24(1):307.