從體外/體內(nèi)-免疫缺陷/體內(nèi)-人源化三個(gè)模型方向?qū)Ρ菴RS評(píng)價(jià)模型
嵌合抗原受體（CAR）T細(xì)胞、雙特異性T細(xì)胞等免疫細(xì)胞治療的研究愈發(fā)火熱，在腫瘤治療中展現(xiàn)出新希望，但同樣面臨著新的挑戰(zhàn)：細(xì)胞因子釋放綜合征（Cytokine Release Syndrome，CRS）
CRS是一種免疫過度激活的現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌過多，如果不加以控制，可能會(huì)導(dǎo)致多器官衰竭和死亡。一篇涉及84項(xiàng)研究中2592名患者的Meta分析顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的所有級(jí)別CRS發(fā)生率分別為：81%、37%，≥3 CRS發(fā)生率分別為：29%、19%[1]。
研究者深知在臨床前實(shí)驗(yàn)初期，不僅要關(guān)注免疫治療效果，同樣要關(guān)注CRS發(fā)生率和嚴(yán)重程度，以采取措施預(yù)防和減緩CRS帶來的毒副作用。
因此，選擇一種合適的研究模型兼顧免疫療法的療效驗(yàn)證與CRS安全性評(píng)估，可以事半功倍。本文將分別從體外模型、體內(nèi)-免疫缺陷模型、體內(nèi)-人源化模型三個(gè)方向?qū)Ρ菴RS評(píng)價(jià)模型的優(yōu)缺點(diǎn)。
體外模型（特異性T細(xì)胞和腫瘤抗原共孵育）可以初步檢測(cè)細(xì)胞因子釋放。
OKT3是一種CD3單克隆抗體，用于促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化。將OKT3或特異性合成的PSMA/CD3雙抗與添加了IL-2的PBMC共孵育，分別得到增殖分化好的T細(xì)胞。將OKT3-T細(xì)胞或雙特異性T細(xì)胞（anti-PSMA/anti-CD3 BsAbs）與LNCaP細(xì)胞共培養(yǎng)，驗(yàn)證雙特異性T細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤的殺傷作用[2]。
體外模型小結(jié)
這種體外模型實(shí)驗(yàn)周期短且成本低，但不能提供有關(guān)全身免疫環(huán)境（血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織固有的免疫細(xì)胞等）、無法驗(yàn)證脫靶效應(yīng)（交叉反應(yīng)、非預(yù)期靶點(diǎn)激活）、神經(jīng)毒性、組織損傷和器官衰竭等，還有可能帶來假陽性結(jié)果，故還需進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
需要注意的是為避免不同供體來源的PBMC本身差異性引發(fā)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的不一致和不可重復(fù)性，選擇穩(wěn)定可靠的優(yōu)質(zhì)供體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。
維通利華持續(xù)篩選優(yōu)質(zhì)供體，滿足研發(fā)者更嚴(yán)謹(jǐn)及精細(xì)化的研發(fā)需求：引入不同供體的差異。
無論是CAR-T細(xì)胞、雙特異性T細(xì)胞或是其它免疫細(xì)胞只有在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)維持和擴(kuò)增才能發(fā)揮作用。SCID Beige鼠：T、B細(xì)胞缺失，NK細(xì)胞有缺陷，腹腔注射Raji細(xì)胞，3周后靜脈回輸CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放水平。CAR-T細(xì)胞回輸前，腫瘤切片染色顯示有浸潤(rùn)性髓系細(xì)胞的表達(dá)，而注射CAR-T細(xì)胞后，鼠源髓系細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)，證明CAR-T細(xì)胞募集并激活鼠源髓系細(xì)胞，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子引發(fā)CRS[3]。
上述研究中用到的SCID Beige鼠為部分免疫缺陷，主要是依賴鼠源髓系細(xì)胞進(jìn)行CRS評(píng)估，同時(shí)小鼠體內(nèi)還缺乏人源細(xì)胞因子和人源免疫系統(tǒng)，T細(xì)胞注射后難以實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增和長(zhǎng)期維持，因而無法準(zhǔn)確進(jìn)行CRS評(píng)價(jià)。
如，使用SCID小鼠評(píng)估雙特異性T細(xì)胞的有效性及安全性實(shí)驗(yàn)[2]，雖然雙特異性T細(xì)胞組展示了很好的抗腫瘤效果（圖10），但可能由于沒有人源免疫細(xì)胞的參與，并沒有引發(fā)大量細(xì)胞因子釋放的毒副作用（圖9）。
體內(nèi)-免疫缺陷模型小結(jié)
CRS的發(fā)生不僅僅是由腫瘤抗原與CAR-T細(xì)胞相互作用引發(fā)，更是多種免疫細(xì)胞相互作用的結(jié)果。因而，需要一種可以重建人源T細(xì)胞、髓系細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的模型，以精確地進(jìn)行CRS評(píng)估。
并且如果體內(nèi)T細(xì)胞的維持和增殖受限，將無法發(fā)揮藥效，還需借助于超重度免疫缺陷鼠NOG及其衍生小鼠（NOG-dKO/NOG-EXL/hIL-2 NOG）的人源化模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
這里我們介紹的免疫系統(tǒng)人源化小鼠主要是指huHSC-NOG-EXL：將huHSC-CD34+移植到NOG-EXL小鼠（轉(zhuǎn)入編碼人IL-3和GM-CSF基因的NOG小鼠），可以重建多種免疫細(xì)胞，包括：T細(xì)胞、B細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，更能模擬人的免疫細(xì)胞組成，呈現(xiàn)更完整的人類免疫系統(tǒng)（圖12）[4]。
客戶合作案例
采用常規(guī)免疫缺陷小鼠荷瘤模型通常情況下觀察到的細(xì)胞因子釋放是有限的 , 不能有效地評(píng)估CAR-T 細(xì)胞治療的安全性。研究結(jié)果表明[5]，當(dāng)在臨床前實(shí)驗(yàn)研究或預(yù)測(cè) CAR-T 細(xì)胞產(chǎn)品的細(xì)胞因子釋放強(qiáng)度時(shí)，相比于常規(guī)的荷瘤小鼠，免疫重建的NOG-EXL小鼠是更適合的模型。研究者使用huHSC-NOG-EXL小鼠，給予腫瘤負(fù)荷并輸注CAR-T細(xì)胞后，可見明顯的各類細(xì)胞因子的釋放（圖13），其中 IL-6 的最高釋放個(gè)體達(dá)到6000 pg/mL 水平。但細(xì)胞因子釋放的時(shí)機(jī)同臨床相比較早，持續(xù)的時(shí)間也較短。
體內(nèi)-人源化模型小結(jié)
回輸CAR-T細(xì)胞，huHSC-NOG-EXL小鼠細(xì)胞因子釋放水平顯著提高。通過Emapalumab單抗治療，細(xì)胞因子釋放得到控制，小鼠生存期明顯改善，表明CRS得到控制，充分證明huHSC-NOG-EXL小鼠是CRS評(píng)價(jià)的優(yōu)選模型。
總結(jié)
CRS（細(xì)胞因子釋放綜合征）通常發(fā)生在免疫細(xì)胞輸注后的幾天內(nèi)，伴隨體內(nèi)免疫細(xì)胞的活化與擴(kuò)增[8,9]。釋放出大量細(xì)胞因子和炎癥因子（如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等），是免疫細(xì)胞治療安全性評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)。在臨床前探究中，
維通利華可以提供huHSC-NOG-EXL現(xiàn)貨模型，節(jié)省前期模型制備時(shí)間，保證免疫系統(tǒng)重建成功，幫助研發(fā)者快速開展實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)
1. Lei W, Xie M, Jiang Q, Xu N, Li P, Liang A, et al. Treatment-related adverse events of chimeric antigen receptor T-cell (CAR T) in clinical trials: a systematic review and meta-analysis. Cancers (Basel) (2021) 13(15):1–25. doi: 10.3390/cancers13153912
2. Yi‑Jou C, Michael C, Tian‑Lu C, et al. A non-genetic engineering platform for rapidly generating and expanding cancer-specifc armed T cells. Journal of Biomedical Science (2023) 30:35. doi.org/10.1186/s12929-023-00929-z
3. Giavridis T, van der Stegen SJC, Eyquem J, Hamieh M, Piersigilli A, Sadelain M. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by IL-1 blockade. Nat Med (2018) 24(6):731–8. doi: 10.1038/s41591-018-0041-7
4. Maser, Ilona Petra , et al. The Tumor Milieu Promotes Functional Human Tumor-Resident Plasmacytoid Dendritic Cells in Humanized Mouse Models. Frontiers in Immunology 11(2020):2082. doi: 10.3389/fimmu.2020.02082
5. JOINN Biologics. “適用于CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品CRS評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型”昭衍JOINN. 28, Apr. 2020.
6. Matthys, P. et al. Modification of the anti-CD3-induced cytokine release syndrome by anti-interferon-gamma or anti-interleukin-6 antibody treatment: protective effects and biphasic changes in blood cytokine levels. Eur. J. Immunol. 23, 2209–2216 (1993).
7. Simona Manni, Francesca Del Bufalo, et al. Neutralizing IFNγ improves safety without compromising efficacy of CAR-T cell therapy in B-cell malignancies. Nat Commun. 2023; 14: 3423. doi: 10.1038/s41467-023-38723-y
8. Wei J, Liu Y, Wang C, Zhang Y, Tong C, Dai G, et al. The model of cytokine release syndrome in CAR T-cell treatment for B-cell non-Hodgkin lymphoma. Signal Transduct Target Ther (2020) 5(1):134. doi: 10.1038/s41392-020-00256-x
9. Morris EC, Neelapu SS, Giavridis T, Sadelain M. Cytokine release syndrome and associated neurotoxicity in cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol (2022) 22(2):85–96. doi: 10.1038/s41577-021-00547-6
CRS是一種免疫過度激活的現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞因子分泌過多，如果不加以控制，可能會(huì)導(dǎo)致多器官衰竭和死亡。一篇涉及84項(xiàng)研究中2592名患者的Meta分析顯示，血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的所有級(jí)別CRS發(fā)生率分別為：81%、37%，≥3 CRS發(fā)生率分別為：29%、19%[1]。
研究者深知在臨床前實(shí)驗(yàn)初期，不僅要關(guān)注免疫治療效果，同樣要關(guān)注CRS發(fā)生率和嚴(yán)重程度，以采取措施預(yù)防和減緩CRS帶來的毒副作用。
因此，選擇一種合適的研究模型兼顧免疫療法的療效驗(yàn)證與CRS安全性評(píng)估，可以事半功倍。本文將分別從體外模型、體內(nèi)-免疫缺陷模型、體內(nèi)-人源化模型三個(gè)方向?qū)Ρ菴RS評(píng)價(jià)模型的優(yōu)缺點(diǎn)。
OKT3是一種CD3單克隆抗體，用于促進(jìn)T細(xì)胞增殖和分化。將OKT3或特異性合成的PSMA/CD3雙抗與添加了IL-2的PBMC共孵育，分別得到增殖分化好的T細(xì)胞。將OKT3-T細(xì)胞或雙特異性T細(xì)胞（anti-PSMA/anti-CD3 BsAbs）與LNCaP細(xì)胞共培養(yǎng)，驗(yàn)證雙特異性T細(xì)胞在體外對(duì)腫瘤的殺傷作用[2]。
- 從健康供體的血液中分離人PBMC，并分別與四種類型的BsAb或傳統(tǒng)的小鼠抗CD3抗體（OKT3）共培養(yǎng)，14天后分化擴(kuò)增出特異性的CD3+CD8+T細(xì)胞（圖1）。
- 雙特異性T細(xì)胞較OKT3-T細(xì)胞展示出更強(qiáng)的對(duì)LNCaP細(xì)胞的殺傷性（圖2），釋放更高量的細(xì)胞因子（IL-2、INF-γ和TNF-α）和細(xì)胞毒素（穿孔素和顆粒酶B）（圖3）。
體外模型小結(jié)
這種體外模型實(shí)驗(yàn)周期短且成本低，但不能提供有關(guān)全身免疫環(huán)境（血管內(nèi)皮細(xì)胞、組織固有的免疫細(xì)胞等）、無法驗(yàn)證脫靶效應(yīng)（交叉反應(yīng)、非預(yù)期靶點(diǎn)激活）、神經(jīng)毒性、組織損傷和器官衰竭等，還有可能帶來假陽性結(jié)果，故還需進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
需要注意的是為避免不同供體來源的PBMC本身差異性引發(fā)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的不一致和不可重復(fù)性，選擇穩(wěn)定可靠的優(yōu)質(zhì)供體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。
維通利華持續(xù)篩選優(yōu)質(zhì)供體，滿足研發(fā)者更嚴(yán)謹(jǐn)及精細(xì)化的研發(fā)需求：引入不同供體的差異。
無論是CAR-T細(xì)胞、雙特異性T細(xì)胞或是其它免疫細(xì)胞只有在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)維持和擴(kuò)增才能發(fā)揮作用。SCID Beige鼠：T、B細(xì)胞缺失，NK細(xì)胞有缺陷，腹腔注射Raji細(xì)胞，3周后靜脈回輸CAR-T細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞因子的釋放水平。CAR-T細(xì)胞回輸前，腫瘤切片染色顯示有浸潤(rùn)性髓系細(xì)胞的表達(dá)，而注射CAR-T細(xì)胞后，鼠源髓系細(xì)胞表達(dá)顯著上調(diào)，證明CAR-T細(xì)胞募集并激活鼠源髓系細(xì)胞，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子引發(fā)CRS[3]。
- 荷瘤小鼠回輸CAR-T細(xì)胞后，體重明顯下降（圖4），整體細(xì)胞因子的表達(dá)水平與生存率及CRS的嚴(yán)重程度密切相關(guān)（圖5）。
- IL-3和GM-CSF是人源CAR-T細(xì)胞產(chǎn)生，而其他細(xì)胞因子如IL-6是由內(nèi)源性鼠源細(xì)胞產(chǎn)生（圖6）。
- CAR-T細(xì)胞注射后主要集中在腹膜部位，脾臟或其他組織中沒有發(fā)現(xiàn)（圖7），腹膜部位的髓系細(xì)胞比例顯著提升（圖8）。
上述研究中用到的SCID Beige鼠為部分免疫缺陷，主要是依賴鼠源髓系細(xì)胞進(jìn)行CRS評(píng)估，同時(shí)小鼠體內(nèi)還缺乏人源細(xì)胞因子和人源免疫系統(tǒng)，T細(xì)胞注射后難以實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增和長(zhǎng)期維持，因而無法準(zhǔn)確進(jìn)行CRS評(píng)價(jià)。
如，使用SCID小鼠評(píng)估雙特異性T細(xì)胞的有效性及安全性實(shí)驗(yàn)[2]，雖然雙特異性T細(xì)胞組展示了很好的抗腫瘤效果（圖10），但可能由于沒有人源免疫細(xì)胞的參與，并沒有引發(fā)大量細(xì)胞因子釋放的毒副作用（圖9）。
體內(nèi)-免疫缺陷模型小結(jié)
并且如果體內(nèi)T細(xì)胞的維持和增殖受限，將無法發(fā)揮藥效，還需借助于超重度免疫缺陷鼠NOG及其衍生小鼠（NOG-dKO/NOG-EXL/hIL-2 NOG）的人源化模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
客戶合作案例
文獻(xiàn)案例
CAR-T細(xì)胞激活后，會(huì)釋放出高水平的IFNγ，誘導(dǎo)激活其他免疫細(xì)胞亞群（主要是巨噬細(xì)胞），隨之產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子，加重炎癥反應(yīng)，提高CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性的同時(shí)，也引發(fā)不良反應(yīng)[6]。本研究[7]證明，Emapalumab(一種針對(duì)IFNγ的單克隆抗體)能夠顯著減弱CAR-T細(xì)胞治療引發(fā)的CRS，而不會(huì)損害CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。
- NSG小鼠模型中，Emapalumab單抗治療不影響CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性(圖14)。
- huHSC-NOG-EXL小鼠移植經(jīng)照射的CD19+Daudi（irrDaudi）FF-LUC細(xì)胞系后靜脈注射CAR-T細(xì)胞，進(jìn)行Emapalumab單抗治療，治療后IFNγ和 IL-6釋放顯著降低(圖15)，但不影響CAR.CD19-T細(xì)胞的擴(kuò)增(圖16)。
- huHSC-NOG-EXL小鼠注射CAR-T細(xì)胞后7天內(nèi)出現(xiàn)死亡，Emapalumab單抗治療的組別小鼠生存情況明顯改善，生存觀察期延長(zhǎng)至15天(圖17)。
體內(nèi)-人源化模型小結(jié)
回輸CAR-T細(xì)胞，huHSC-NOG-EXL小鼠細(xì)胞因子釋放水平顯著提高。通過Emapalumab單抗治療，細(xì)胞因子釋放得到控制，小鼠生存期明顯改善，表明CRS得到控制，充分證明huHSC-NOG-EXL小鼠是CRS評(píng)價(jià)的優(yōu)選模型。
總結(jié)
CRS（細(xì)胞因子釋放綜合征）通常發(fā)生在免疫細(xì)胞輸注后的幾天內(nèi)，伴隨體內(nèi)免疫細(xì)胞的活化與擴(kuò)增[8,9]。釋放出大量細(xì)胞因子和炎癥因子（如IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等），是免疫細(xì)胞治療安全性評(píng)價(jià)中的重要指標(biāo)。在臨床前探究中，
- 體外CRS模型：可用于臨床前安評(píng)的初級(jí)評(píng)估，由于無法反映T細(xì)胞及其產(chǎn)生的細(xì)胞因子對(duì)其它免疫細(xì)胞的影響以及相互作用，還需要結(jié)合體內(nèi)模型。
- 體內(nèi)CRS模型：免疫缺陷小鼠可部分模擬細(xì)胞藥物與腫瘤在體內(nèi)的相互作用。然而因缺乏人免疫系統(tǒng)和細(xì)胞因子的表達(dá)，T細(xì)胞的增殖分化受限，并且會(huì)受到鼠源免疫細(xì)胞的影響。免疫系統(tǒng)人源化模型huHSC-NOG-EXL鼠源免疫功能超重度缺陷，并可重建多種人免疫細(xì)胞（T細(xì)胞、髓系細(xì)胞等），進(jìn)一步模擬人的免疫系統(tǒng)，在臨床前為細(xì)胞療法引發(fā)的CRS提供適宜的研究環(huán)境。
維通利華可以提供huHSC-NOG-EXL現(xiàn)貨模型，節(jié)省前期模型制備時(shí)間，保證免疫系統(tǒng)重建成功，幫助研發(fā)者快速開展實(shí)驗(yàn)。
參考文獻(xiàn)
1. Lei W, Xie M, Jiang Q, Xu N, Li P, Liang A, et al. Treatment-related adverse events of chimeric antigen receptor T-cell (CAR T) in clinical trials: a systematic review and meta-analysis. Cancers (Basel) (2021) 13(15):1–25. doi: 10.3390/cancers13153912
2. Yi‑Jou C, Michael C, Tian‑Lu C, et al. A non-genetic engineering platform for rapidly generating and expanding cancer-specifc armed T cells. Journal of Biomedical Science (2023) 30:35. doi.org/10.1186/s12929-023-00929-z
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4. Maser, Ilona Petra , et al. The Tumor Milieu Promotes Functional Human Tumor-Resident Plasmacytoid Dendritic Cells in Humanized Mouse Models. Frontiers in Immunology 11(2020):2082. doi: 10.3389/fimmu.2020.02082
5. JOINN Biologics. “適用于CAR-T細(xì)胞治療產(chǎn)品CRS評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型”昭衍JOINN. 28, Apr. 2020.
6. Matthys, P. et al. Modification of the anti-CD3-induced cytokine release syndrome by anti-interferon-gamma or anti-interleukin-6 antibody treatment: protective effects and biphasic changes in blood cytokine levels. Eur. J. Immunol. 23, 2209–2216 (1993).
7. Simona Manni, Francesca Del Bufalo, et al. Neutralizing IFNγ improves safety without compromising efficacy of CAR-T cell therapy in B-cell malignancies. Nat Commun. 2023; 14: 3423. doi: 10.1038/s41467-023-38723-y
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9. Morris EC, Neelapu SS, Giavridis T, Sadelain M. Cytokine release syndrome and associated neurotoxicity in cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol (2022) 22(2):85–96. doi: 10.1038/s41577-021-00547-6
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