蛋白原核表達(dá)純化驗(yàn)證相關(guān)介紹

一．原核誘導(dǎo)表達(dá)原理
一旦由lacI細(xì)胞所形成的阻遏蛋白與lac操縱子融合后，就無法影響外部基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)了，也就從而保證了宿主細(xì)胞的健康生長。IPTG同時(shí)也是一種可以與乳糖水解融合的中間物質(zhì)，它雖然無法被細(xì)胞所同化，但卻能夠與阻遏蛋白的結(jié)合，這樣細(xì)胞也就可以控制外源融資基因的大量轉(zhuǎn)錄和高效表達(dá)。
 
二．誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化策略
1.增加蛋白質(zhì)溶解性和折疊：高溫易使蛋白質(zhì)以聚集的形式表達(dá)成包涵體，可選擇低溫誘導(dǎo)表達(dá)。
2.提高翻譯水平：調(diào)整SD序列與AUG間的距離、點(diǎn)突變改變堿基、增加mRNA穩(wěn)定性。
3.減輕細(xì)胞的代謝負(fù)荷，提高表達(dá)水平：將細(xì)菌的生長與外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)分開；使用化學(xué)誘導(dǎo)、溫度誘導(dǎo)等。
4.稀有密碼子優(yōu)化：多數(shù)氨基酸有一個(gè)以上的密碼子，當(dāng)異源靶基因的mRNA異常表達(dá)后，tRNA的數(shù)量直接反應(yīng)密碼子的偏好性，一個(gè)或多個(gè)tRNA的稀有或缺少會(huì)導(dǎo)致翻譯的停止。 

三．重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)流程
（1）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因。
（2）按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。
（3）挑取陽性菌落將其加入至5mL Lb（0.1 g/l氨芐青霉素）內(nèi)，在37℃培養(yǎng)下過夜。
（4）以2 %體積比轉(zhuǎn)接于2 mL LB( 0.1 g/L氨芐青霉素)中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5 h，至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期，加0.1 mmol/L IPTG 2 µL誘導(dǎo)3-4 h，同時(shí)設(shè)立不加IPTG誘導(dǎo)作為對(duì)照。
（5）取上述菌液1 mL，12000 rpm離心10min，收菌沉淀。
（6）重懸于冰的100 µL PBS中，加入PMSF至終濃度為10 mmoL/L。震蕩器震蕩混勻，加入2×加樣緩沖液，煮沸10 min變性，12,000 rpm離心10 min。
（7）將誘導(dǎo)的前后樣品各10µL，作SDS-PAGE電泳分析。
 
三. SDS-PAGE驗(yàn)證蛋白表達(dá)純化結(jié)果1. SDS-PAGE實(shí)驗(yàn)原理：
1.帶電粒子在電場中游動(dòng)的速度與電場強(qiáng)度和帶電粒子的凈電荷成正比，與粒子半徑（分子量和結(jié)構(gòu)）和介質(zhì)的粘度成反比。如果試劑為混合蛋白質(zhì)溶液，則各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的原子數(shù)量不同，這樣在電泳時(shí)，產(chǎn)生了不同的電子遷移帶。
2. 實(shí)驗(yàn)流程：
(1)凝膠的制備：配置分離膠，ddH2O 4.0mL，30%儲(chǔ)備膠3.3mL， 1.5M Tris-HCl 2.5mL，10%SDS 0.1mL，10%APS 0.1mL。將上述的混合物一mL后，用TEMED（N，N，N'N'-四亞甲基二胺）10個(gè)μL封住底部，再將余下的μL，拌和均勻后，以用百分之二十乙醇溶液填充的玻璃版，蒙頭頂部。確保液位是平的。濃縮膠用ddH2O 1.4mL，30%儲(chǔ)備膠0.33mL，1M Tris-HCl 0.25mL，10%SDS 0.02mL，10%APS 0.02mL，TEMED 2μL制備。去除或分離膠內(nèi)的水分之后，再重新倒入混合物，然后迅速的把篦子放入玻璃內(nèi)充分聚合，需時(shí)間約15-30min。
(2)加樣及電泳：將樣品中加入一定量的2xSDS緩沖液中，加熱3-5分鐘，于12000g時(shí)離心1分鐘，再取上等清液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。將10uL誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)處理的樣品加入樣品池中，并將蛋白質(zhì)標(biāo)記物加入相鄰泳道中。將電泳緩沖液注入電泳槽，并接通電源，濃縮膠的電壓約為80V，而分離膠電壓則是120V，溴酚藍(lán)到底時(shí)電泳結(jié)束。
(3)蛋白質(zhì)的染色和脫色：將膠從玻璃板中取出，考馬斯亮藍(lán)染色液染色，室溫4-6 h。染色完畢后，將膠從染色液中取出，放入脫色液中，多次脫色至蛋白帶清晰。
(4）膠片攝像的保存：在圖像處理模式下將已經(jīng)脫色過的膠片攝像，結(jié)果保存于計(jì)算機(jī)中，而膠可保存于雙蒸水中。3. SDS-PAGE常見問題及解決方法

常見問題	出現(xiàn)原因	解決辦法
條帶拖尾	膠濃度過大/樣品溶解效果不好	樣品離心震蕩；電泳緩沖液現(xiàn)用現(xiàn)配；降低凝膠濃度
中間凹兩邊翹	凝膠中間凝固不均勻	充分凝固后操作
中間凸兩邊凹	板間底部有氣泡	加適量緩沖液排除氣泡
條帶粗	未濃縮好	適當(dāng)增加濃縮膠長度；保證電壓穩(wěn)定；保證儲(chǔ)液pH正確
加樣孔底部有沉淀	還原劑失活使蛋白質(zhì)分子聚合成大分子	添加適量DTT或β-巰基乙醇；補(bǔ)充EDTA阻止還原劑氧化
出現(xiàn)紋理	樣品有不溶顆粒	加促溶劑/加樣前離心

4. 結(jié)果展示：
大小為43KDa的某融合蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)前后的SDS-PAGE結(jié)果： M：蛋白Marker；泳道1、3、5：3株單克隆菌株誘導(dǎo)前；泳道2、4、6：3株單克隆菌株誘導(dǎo)后。
 
五. 電泳技術(shù)的應(yīng)用場景：
1.臨床醫(yī)學(xué)：電泳技術(shù)在臨床診斷中發(fā)揮重要作用，為檢測同工酶、各種蛋白質(zhì)等提供了新手段。
2.生物制藥、藥物篩選與分析：分析生物樣本中的藥物及其代謝產(chǎn)物、分析藥物雜質(zhì)、分析重要等。
3.食品安全及微生物鑒定：樣品條帶可反應(yīng)不同樣品間的群落相似性，與飛行時(shí)間質(zhì)譜、電化學(xué)檢測儀等結(jié)合使用，提高痕量檢測的可靠性。
4.農(nóng)業(yè)畜牧業(yè)生產(chǎn)：可用于雜種后代的鑒定，親緣關(guān)系分析，遺傳基因定位等多種方面。
 
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