全基因組DNA甲基化測(cè)序揭示兒童哮喘增強(qiáng)子區(qū)域的整體低甲基化

哮喘（asthma）是兒童期最常見的慢性炎癥性疾病，患病率2.6%~30.5%，兒童哮喘是世界范圍內(nèi)的一個(gè)主要健康問題。兒童哮喘是遺傳和環(huán)境因素復(fù)雜互作結(jié)果，可導(dǎo)致表觀遺傳和免疫失調(diào)、氣道炎癥和肺功能受損。先前研究利用850K芯片對(duì)哮喘的DNA甲基化變化的靶點(diǎn)特異性分析或DNA甲基化微陣列進(jìn)行了描述，覆蓋人類基因組約28M CpG中的27K-850K個(gè)CpG位點(diǎn)。由于850K芯片對(duì)基因組覆蓋范圍有限，目前對(duì)兒童哮喘增強(qiáng)子區(qū)域（enhancer region）失調(diào)知之甚少，因此表觀遺傳學(xué)調(diào)控在哮喘發(fā)展中的影響仍然廣泛未知。
 
2023年1月27日，德國(guó)肺病研究中心（DZL）Irina Lehmann教授團(tuán)隊(duì)在《Allergy》雜志發(fā)表題為“Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions”的研究論文，該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）對(duì)三個(gè)獨(dú)立前瞻性出生隊(duì)列的40名哮喘兒童與42名性別和年齡匹配對(duì)照的的全血樣本進(jìn)行DNA甲基化比較分析，鑒定出增強(qiáng)子區(qū)域DNA甲基化顯著失調(diào)是兒童哮喘的重要標(biāo)記。
標(biāo)題：Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions（全基因組DNA甲基化測(cè)序鑒定兒童哮喘的整體低甲基化優(yōu)先靶向增強(qiáng)子區(qū)域）
發(fā)表期刊：Allergy      
發(fā)表日期：2023年01月27日    
影響因子：IF 12.4
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）等
樣品及方法：

• 三個(gè)獨(dú)立前瞻性出生隊(duì)列的40名哮喘兒童與42名性別和年齡匹配對(duì)照的的全血樣本進(jìn)行全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）分析。
• 已鑒定的差異甲基化區(qū)域（DMRs）分為基因型相關(guān)、細(xì)胞類型依賴或產(chǎn)前預(yù)激。
• DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)分析和隨后的自然語(yǔ)言處理（natural language processing，NLP）在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上表觀遺傳調(diào)控功能翻譯的靶向分析得到補(bǔ)充。

 
摘要
本研究應(yīng)用無偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）來表征哮喘兒童與健康對(duì)照組相比的整體DNA甲基化譜。WGBS分析結(jié)果表明與對(duì)照組相比，哮喘兒童全血樣本中共鑒定出158個(gè)DMR，其中37%與嗜酸性粒細(xì)胞含量相關(guān)。研究還鑒定出主要影響增強(qiáng)子區(qū)域并調(diào)控關(guān)鍵免疫基因（如IL4、IL5RA和EPX）的整體低甲基化。這些DMR在n=267個(gè)樣本中得到驗(yàn)證可能與異�；�因表達(dá)有關(guān)。在已建立表型中鑒定的158個(gè)DMR中有56個(gè)在出生時(shí)就已經(jīng)受到影響，至少部分與產(chǎn)前影響有關(guān)（如產(chǎn)前煙草煙霧暴露或鄰苯二甲酸鹽暴露）。
圖形摘要
全血的全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序鑒定出158個(gè)與兒童哮喘相關(guān)的DMR，主要靶向增強(qiáng)子區(qū)域，包括IL-4的增強(qiáng)子。哮喘表型中的整體DNA低甲基化調(diào)控關(guān)鍵免疫基因，如IL5RA或EPX。哮喘中35%的異常DNA甲基化存在于臍帶血中，一定程度上與吸煙等不良產(chǎn)前影響有關(guān)。
 
縮寫：
DMR：differentially methylated region, 差異甲基化區(qū)域
WGBS：whole-genome bisulfite sequencing，全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序
EPX：eosinophil peroxidase，嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶
IL5RA：interleukin 5 receptor subunit alpha，白細(xì)胞介素5受體亞基α
LINA：Lifestyle and environmental factors and their influence on newborns allergy risk，生活方式和環(huán)境因素及其對(duì)新生兒過敏風(fēng)險(xiǎn)的影響
LISA：Lifestyle-related factors on the immune system and the development of allergies in childhood;，生活方式相關(guān)因素對(duì)免疫系統(tǒng)和兒童過敏發(fā)展的影響
PASTURE：Protection against allergy: study in rural environments，抗過敏：農(nóng)村環(huán)境研究
 

研究結(jié)果：
（1）兒童哮喘的全基因組DNA低甲基化
圖1：研究設(shè)計(jì)。對(duì)三個(gè)隊(duì)列的哮喘兒童患者和對(duì)照組兒童的血樣進(jìn)行WGBS，以鑒定哮喘相關(guān)的DMR。通過兩種獨(dú)立的DMR calling算法DSS和metilene來分析比較哮喘兒童和對(duì)照兒童的DMR。隨后對(duì)哮喘相關(guān)DMR進(jìn)行了分析。¹基于LINA和PASTURE的臍帶血樣本。²基于LINA和LISA的可用全血樣本。³基于LINA的可用血漿樣品。
表1：全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序 （WGBS） 的 LINA、LISA 和 PASTURE 亞隊(duì)列特征
LQ=下四分位數(shù)，UQ=上四分位數(shù)。
^a Fisher精確測(cè)試。
^b對(duì)照組僅從非特應(yīng)性兒童中選擇。
^c Mann–Whitney U型測(cè)試。

圖2：DMR分布和下游分析。
（A） Circos圖表示哮喘兒童與對(duì)照組中鑒定的158個(gè)差異甲基化區(qū)域（DMR）在所有常染色體中的分布。外圈顯示22個(gè)常染色體。內(nèi)圈條形圖代表DMR及其染色體位置。高甲基化DMR用紅色條表示，低甲基化DMRs用藍(lán)色條表示。每個(gè)條的高度表示哮喘患者和對(duì)照組之間的DNA甲基化差異。
（B） 基于基因組位點(diǎn)的所有哮喘DMR的KEGG通路富集。
（C） 分別通過測(cè)序或MassARRAY檢測(cè)哮喘兒童與WGBS樣本（哮喘n=40，對(duì)照n=42）、LINA研究（哮喘n=19，對(duì)照n=108）和LISA研究（哮喘病n=25，對(duì)照n=115）中與EPX和IL5RA相關(guān)DMR的DNA甲基化差異（p值來自Mann–Whitney U-test，rpb：點(diǎn)雙序列相關(guān)系數(shù)）。
（D） 結(jié)合LINA和LISA研究的meta分析中，EPX和IL5RA DNA甲基化（黑須）和轉(zhuǎn)錄（洋紅色須）與哮喘結(jié)局相關(guān)性。(DNA甲基化：哮喘n=44，對(duì)照組n=223, EPX轉(zhuǎn)錄：哮喘n=44，對(duì)照組n = 220, IL5RA轉(zhuǎn)錄：哮喘n=44，對(duì)照組n=222)�？紤]到兒童性別、隊(duì)列、產(chǎn)前煙草煙霧暴露、特應(yīng)性體質(zhì)家族史、父母受教育程度和出生時(shí)母親年齡等因素，采用ln-轉(zhuǎn)化DNA甲基化值進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸校正后的OR值為+/-95%CI。

（2）遺傳和細(xì)胞類型組成對(duì)哮喘相關(guān)DMR的影響
由于DNA甲基化水平可能強(qiáng)烈依賴于基因型或細(xì)胞類型組成，因此根據(jù)細(xì)胞類型依賴性和基因型相關(guān)性（gDMR）對(duì)哮喘相關(guān)DMR進(jìn)行分類。根據(jù)這一分類，158個(gè)DMR中有38個(gè)（24.1%）與遺傳背景有關(guān)，而其余120個(gè)DMR（75.9%）為非基因型相關(guān)DMR（ngDMR）。共鑒定出465個(gè)與38個(gè)gDMR相關(guān)的meQTL，其中沒有一個(gè)在此前的全基因組關(guān)聯(lián)研究中被描述為哮喘風(fēng)險(xiǎn)因子。包括GWAS目錄中的所有表型性狀，共有14個(gè)DMR至少與一個(gè)性狀相關(guān)。對(duì)于其中8個(gè)DMR，該性狀顯示出與哮喘的松散表型關(guān)聯(lián)，包括肺功能（rs645601和rs7700998）。五個(gè)SNPs與不同血細(xì)胞類型計(jì)數(shù)相關(guān)，其中RPN1-DMR上游的rs4328821和rs7646596與嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)。此外，與MAD1L1-DMR相關(guān)的rs12699415與特發(fā)性肺纖維化相關(guān)。
此外，研究表明哮喘兒童血液中嗜酸性粒細(xì)胞頻率增加（Mann-Whitney U檢驗(yàn)：Z=3.42，rpb=0.32，p=0.017），但其余細(xì)胞類型（B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞或中性粒細(xì)胞）沒有增加。采用校正后的多元回歸分析來檢驗(yàn)不同的細(xì)胞類型頻率是否對(duì)所確定的DMR的DNA甲基化水平有影響，結(jié)果顯示37%的哮喘DMR（58個(gè)DMR）與嗜酸性粒細(xì)胞比例有關(guān)，只有三個(gè)DMR與B細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞、NK細(xì)胞或中性粒細(xì)胞相關(guān)。然而，即使在校正后的多元回歸模型中考慮了這些細(xì)胞類型后，哮喘仍然是所有細(xì)胞類型依賴性DMR DNA甲基化狀態(tài)的重要影響因子。
 
（3）DNA甲基化變化模式與免疫調(diào)節(jié)異常相關(guān)

表2：目標(biāo)分析中考慮的LINA和LISA隊(duì)列的特征
 

（4）哮喘中DNA甲基化變化影響調(diào)控中樞
圖3：哮喘相關(guān)DMR的基因組定位和IL4增強(qiáng)子低甲基化的功能翻譯。
（A） 餅圖表示受哮喘相關(guān)DMR影響的基因組區(qū)域比例分布。
（B） 在UCSC基因組瀏覽器中，IL4 DMR和MassARRAY分析的基因組位點(diǎn)和基因組區(qū)域。
（C） 散點(diǎn)圖顯示在LINA研究的6歲兒童中，IL4 DNA甲基化與IL4轉(zhuǎn)錄（n=112）和IL-4蛋白濃度（n=115）的關(guān)聯(lián)，以及IL-4蛋白濃度與IL4逆轉(zhuǎn)錄（n=111）的關(guān)聯(lián)。相關(guān)系數(shù)（ρ）和p值來自Spearman。（D） 6歲LINA兒童IL4增強(qiáng)子DNA甲基化、IL4轉(zhuǎn)錄和IL-4蛋白濃度關(guān)系的中介分析（n=111）。模型根據(jù)兒童性別、產(chǎn)前煙草煙霧暴露、特應(yīng)性體質(zhì)家族史、父母受教育程度和出生時(shí)的母親年齡進(jìn)行校正。在PHA刺激后檢測(cè)IL-4蛋白濃度。蛋白質(zhì)和DNA甲基化數(shù)據(jù)在分析前進(jìn)行l(wèi)n轉(zhuǎn)換。間接路徑效應(yīng)大小以標(biāo)準(zhǔn)化β值表示（+/-95% CI）。通過偏差校正自舉確定顯著性。MA＝MassARRAY，DMR＝差異甲基化區(qū)域。


（5）受DNA甲基化變化調(diào)控基因在功能上相互關(guān)聯(lián)
圖4：哮喘DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)模塊分析。所有哮喘DMR相關(guān)基因顯示出預(yù)測(cè)或基于實(shí)驗(yàn)的互作關(guān)系。僅顯示具有多個(gè)連接的模塊。受DMR調(diào)控的增強(qiáng)子靶基因由藍(lán)色輪廓圓圈突出顯示。由自然語(yǔ)言處理工具確定的哮喘相關(guān)基因或類似基因用紅色字體表示。模塊命名基于通路富集分析。
 

（6）哮喘的產(chǎn)前預(yù)激（Prenatal priming for asthma）
圖5：臍帶血哮喘DMR。
（A） 對(duì)匹配的臍帶血樣本進(jìn)行WGBS測(cè)序，以確定對(duì)照組兒童與后來發(fā)展為哮喘的兒童相比，出生時(shí)哮喘相關(guān)DMR的DNA甲基化水平。
（B） 餅圖表示部分基因型和非基因型相關(guān)DMR（g/ngDMR）以及那些已經(jīng)在臍帶血樣本中差異甲基化的DMR（=臍帶血DMR）。該表列出了之前與56個(gè)臍血哮喘相關(guān)DMR中包含的CPG相關(guān)的所有產(chǎn)前影響因素。紅色字體突出顯示通過自然語(yǔ)言處理鑒定的哮喘基因，以淺藍(lán)色顯示ngDMR，深藍(lán)色表示gDMR。
增強(qiáng)子靶基因來源于GeneHancer，在沒有GeneHancher注釋的情況下，給出最接近的TSS基因。（C） 臍帶血DMR相關(guān)基因的網(wǎng)絡(luò)模塊分析（左圖）和僅存在于哮喘表型中的DMR相關(guān)基因網(wǎng)絡(luò)模型分析（右圖）。僅顯示具有多個(gè)連接的模塊。模塊命名基于圖4的網(wǎng)絡(luò)。PFOS：perfluorooctane sulfonic acid，全氟辛烷磺酸，NLP：natural language processing，自然語(yǔ)言處理。


參考文獻(xiàn)：
Thürmann L, Klös M, Mackowiak SD, Bieg M, Bauer T, Ishaque N, Messingschlager M, Herrmann C, Röder S, Bauer M, Schäuble S, Faessler E, Hahn U, Weichenhan D, Mücke O, Plass C, Borte M, von Mutius E, Stangl GI, Lauener R, Karvonen AM, Divaret-Chauveau A, Riedler J, Heinrich J, Standl M, von Berg A, Schaaf B, Herberth G, Kabesch M, Eils R, Trump S, Lehmann I. Global hypomethylation in childhood asthma identified by genome-wide DNA-methylation sequencing preferentially affects enhancer regions. Allergy. 2023 Jun;78(6):1489-1506.