馬英新團(tuán)隊(duì)開發(fā)RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)，用于快速靈敏檢測非洲豬瘟

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的一種急性、出血性、高傳染性的豬疾病。迄今為止，仍然沒有廣泛有效的疫苗和治療方式用于應(yīng)對非洲豬瘟，通常依靠快速診斷和撲殺感染豬等手段對疫情進(jìn)行有效控制。

      目前，對于非洲豬瘟的診斷主要依賴于PCR技術(shù)，該技術(shù)依賴于儀器設(shè)備和專業(yè)操作人員，只能在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，無法滿足現(xiàn)場診斷的需求。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）、滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）等，具有高效、簡便易行等優(yōu)勢，但其靈敏度有限，難以單獨(dú)用于分子診斷。通過與CRISPR-Cas系統(tǒng)聯(lián)用，靈敏度顯著提高，可增加分子診斷的準(zhǔn)確性。然而，目前常用的單模式熒光檢測法或比色檢測法易受到環(huán)境干擾，造成檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確。

該論文首次構(gòu)建了基于RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的非洲豬瘟病毒（ASFV）比色-熒光雙模式檢測策略，通過構(gòu)建新型磁珠-酶報(bào)告系統(tǒng)，結(jié)合RPA-CRISPR/Cas12a技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測。

該方法能實(shí)現(xiàn)對單拷貝病毒基因組檢測，可用于便攜式可視化診斷，且在臨床樣本應(yīng)用中展現(xiàn)了良好的檢測性能，為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有力工具。

超高靈敏CRISPR-Cas12a分子診斷傳感器構(gòu)建用于非洲豬瘟病毒感染快速篩查

      本研究開發(fā)了一種結(jié)合RPA、CRISPR/Cas12a和磁珠-酶新型報(bào)告系統(tǒng)，用于ASFV基因的快速精準(zhǔn)診斷的方法。如圖1所示，biotin-ssDNA-azide與DBCO修飾的堿性磷酸酶（ALP）通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)合成biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與鏈霉親和素修飾的磁珠（SA-MB）結(jié)合獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告系統(tǒng)。用RPA擴(kuò)增ASFV基因序列，獲得擴(kuò)增子，擴(kuò)增子與Cas12a-crRNA復(fù)合物結(jié)合，激活Cas12a反式切割活性，切割MB-ssDNA-ALP上的ssDNA，釋放ALP；ALP催化pNPP水解生成pNP，引起比色信號變化，再加入量子點(diǎn)作為熒光報(bào)告子，實(shí)現(xiàn)比色和熒光的雙模式信號輸出。

圖1:探針構(gòu)建及ASFV檢測原理圖

     
biotin-ssDNA-azide與DBCO-ALP通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)獲得biotin-ssDNA-ALP，biotin-ssDNA-ALP與SA-MB偶聯(lián)獲得MB-ssDNA-ALP報(bào)告子。RPA擴(kuò)增ASFV基因，擴(kuò)增子激活Cas12a-crRNA復(fù)合物，Cas12a非特異性切割biotin-ssDNA-ALP報(bào)告子，釋放ALP；ALP水解pNPP，生成黃色pNP，加入藍(lán)色QDs后，在內(nèi)濾效應(yīng)作用下，藍(lán)色QDs熒光被猝滅。

在該研究中，團(tuán)隊(duì)首先合成、表征了biotin-ssDNA-ALP，并驗(yàn)證了biotin-ssDNA-N3與DBCO修飾ALP的偶聯(lián)以及MB-ssDNA-ALP探針的合成。然后，考察了RPA擴(kuò)增ASFV基因的能力。以高度保守的ASFV B646L基因?yàn)榘袠?biāo)，設(shè)計(jì)了三對RPA引物，通過瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了三對引物都可高效擴(kuò)增ASFV基因。接著，驗(yàn)證了CRISPR-Cas12a靶向剪切ASFV基因的能力。設(shè)計(jì)靶向三個(gè)RPA擴(kuò)增子序列的crRNA，利用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證了Cas12a被激活并切割RPA擴(kuò)增子。最后，結(jié)合合成的MB-ssDNA-ALP探針、RPA-CRISPR/Cas12a系統(tǒng)以及藍(lán)色CdZnSe QDs，實(shí)現(xiàn)了對ASFV基因的比色-熒光雙模式精準(zhǔn)檢測，靈敏度達(dá)20 copies/mL，可視化檢測104 copies/mL（圖 2A-2D）。

      磁分離技術(shù)的使用可有效降低背景信號，實(shí)現(xiàn)高信噪比檢測。對比發(fā)現(xiàn)本研究開發(fā)的檢測方法靈敏度高于qPCR，且具有良好的特異性，探針不與其它豬疾病相關(guān)病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同時(shí)，還探究了該方法在實(shí)際樣本中的檢測能力，對12份豬血真實(shí)樣本進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示該檢測方法具有100%的準(zhǔn)確度（圖2E和2F）。本方法結(jié)合熒光法的高靈敏度和比色法的易讀性，具有良好的靈敏度、便攜性和特異性，為病毒感染的快速、精準(zhǔn)診斷提供了有效工具。

圖2 比色-熒光雙模式檢測ASFV基因。
（A）不同濃度ASFV基因下，pNP的紫外光譜。
（B）400 nm處吸光度與ASFV基因濃度的對數(shù)值之間的線性關(guān)系。
（C）不同濃度ASFV基因下，CdZnSe QDs的熒光光譜。
（D）熒光強(qiáng)度變化與ASFV基因濃度的對數(shù)值之間的線性關(guān)系。
比色（E）和熒光（F）檢測方法用于臨床樣本的分析結(jié)果。
可視化檢測結(jié)果均列于圖片上方。

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