恒溫擴增結(jié)合CRISPR技術(shù)應(yīng)用

近年來，基于CRISPR的核酸檢測方法，因其較高的特異性和靈敏度，也已被應(yīng)用于感染類診斷方法的開發(fā)。CRISPR診斷方法crRNA準確識別核酸靶標序列，并激活CRISPR蛋白剪切報告分子，從而釋放出信號實現(xiàn)靶標的檢測。然而，由于缺乏合適技術(shù)的引入和集成，現(xiàn)有大多數(shù)CRISPR診斷平臺仍只能檢測少數(shù)核酸靶標分子，那么結(jié)合恒溫擴增技術(shù)又會碰撞出怎樣的火花？

MIRA與Cas12a檢測體系原理：
目的基因經(jīng)過恒溫擴增富集，Cas12-crRNA復(fù)合體識別目的基因，激活Cas蛋白的切割活性，從而切割報告探針，釋放熒光型號，結(jié)果讀取可以為熒光曲線、藍光燈下肉眼觀察；膠體金探針被切割，就可以通過試紙條顯色方式結(jié)果判定。

MIRA結(jié)合Cas13a檢測原理：
  通過恒溫擴增來富集目的基因產(chǎn)物，與Cas12前端擴增區(qū)別點在于，Cas13a前端的恒溫擴增產(chǎn)物有T7啟動子序列，經(jīng)過T7轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為單鏈RNA，此單鏈RNA被Cas13-crRNA復(fù)合體識別，Cas13的切割活性被激活，切割報告探針。結(jié)果呈現(xiàn)和Cas12一樣有熒光型、肉眼判讀、膠體金型等。

不管是Cas12或Cas13的檢測都離不開前端核酸的擴增，因此前端的MIRA基礎(chǔ)型核酸擴增至關(guān)重要，同時前端核酸擴增的靈敏度決定后端Cas蛋白檢測的靈敏度。

如何提高前端MIRA擴增的靈敏度呢？

首先最基礎(chǔ)的就是引物篩選，不同引物組合擴增效率、靈敏度是有差異的，一定要篩選到最優(yōu)引物組合后才能進入Cas體系的檢測。

MIRA+cas12a的體系配制

  MIRA擴增體系，包括：緩沖buffer、上下游引物、模板、啟動buffer、水補充到50ul體系

  Cas12a切割體系包括：緩沖Buffer、Cas12a蛋白、恒溫擴增產(chǎn)物、crRNA等

注意：MIRA恒溫擴增產(chǎn)物是不需要任何處理直接加入到cas蛋白切割體系的。

MIRA+cas13a體系配制

  MIRA基礎(chǔ)擴增體系，包括：緩沖buffer、上下游引物、模板、啟動buffer、水補充到50ul體系

  Cas13a體系，包括：cas13a蛋白、恒溫擴增產(chǎn)物、crRNA、報告探針、RNA酶抑制劑、轉(zhuǎn)錄所需緩沖buffer、T7轉(zhuǎn)錄酶、A/C/G/U轉(zhuǎn)錄所需輔料等，

再次強調(diào)：同樣，MIRA擴增產(chǎn)物也不需要任何處理可直接加入到Cas13a切割體系的。

兩種切割體系對比：

    cas12a需要有TTTV的PAM區(qū)，cas13a不需要；

    cas12a蛋白被雙鏈DNA激活切割活性，Cas13a被單鏈RNA激活切割活性；

    cas12a切割單鏈DNA，因此報告探針設(shè)計為單鏈DNA；

同樣cas13a切割單鏈RNA，報告探針設(shè)計為單鏈RNA；
前端MIRA擴增，引物設(shè)計區(qū)別在于Cas13a需要在上引物加上T7啟動子序列；最終的試紙條檢測所用試紙條均為CRISPR專用試紙條，而非普通核酸檢測試紙條。
MIRA結(jié)合CRISPR檢測應(yīng)用場景多樣化，由于不受溫度條件、設(shè)備限制及環(huán)境條件的約束，可應(yīng)用到社區(qū)醫(yī)院、社區(qū)監(jiān)測站、海關(guān)檢疫、家用自測等多方面。

武漢大學(xué)殷浩老師課題組發(fā)表的，建立了MIRA結(jié)合cas12一管法檢測平臺。本文章為提高一管法靈敏度及檢測時間使用次優(yōu)PAM區(qū)做了一系列的驗證。

推測一：在一管法反應(yīng)中，CRISPR檢測即Cas蛋白切割與恒溫擴增可能存在競爭關(guān)系，標準PAM與cas蛋白結(jié)合力強，使這種競爭關(guān)系偏向于cas蛋白切割，導(dǎo)致恒溫擴增底物缺乏而延遲或停止擴增，最終導(dǎo)致信號延遲、靈敏度下降。

如何降低Cas蛋白結(jié)合活性呢？

換成次優(yōu)PAM，就可得出如下推斷？

次優(yōu)PAM→cas12a順式切割活性降低→短時間內(nèi)恒溫擴增底物增加激活更多cas蛋白→靈敏度、反應(yīng)速度提高。

 為驗證以上推測，作者對次優(yōu)PAM進行探究；首先標準PAM的第一個核苷酸如果換成其他會是什么樣的結(jié)果呢？
作者以新冠Orf基因為例，對第一個核苷酸變更的次優(yōu)PAM進行了兩步法、一步法數(shù)據(jù)驗證，發(fā)現(xiàn)兩步法時標準PAM優(yōu)于次優(yōu)PAM，一步法時次優(yōu)PAM檢測優(yōu)于標準PAM。說明標準PAM第一個核苷酸變更對一管法是有檢測意義的。
那么標準PAM的第2/3/4個核苷酸變更后是否效果更優(yōu)呢？
 PAM堿基變更是否有規(guī)律性呢？

對標準PAM的第二個核苷酸也進行了變更驗證，將T變更為A/G/C，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第二個堿基為C時一管法反應(yīng)效果更好。

對標準PAM第3/4個核苷酸變更也做了一系列驗證，發(fā)現(xiàn)也是有一定規(guī)律，具體結(jié)果可以看殷浩老師的文章。

 

  以上驗證均以新冠的ORF基因、E基因、N基因為檢測基因得出的數(shù)據(jù)，僅為RNA型核酸檢測是否能說明這一規(guī)律呢？

  作者進行了DNA型核酸檢測此處選用HPV18，對這一規(guī)律進行驗證，發(fā)現(xiàn)是適用的,具體結(jié)果見文章詳情。

經(jīng)過大量的測試最終得出結(jié)論，80%以上的次優(yōu)PAM會在一管法反應(yīng)中熒光信號強度增強、檢測時間縮短。得出最優(yōu)次優(yōu)PAM為VTTV,第二次優(yōu)為TCTV。

驗證了次優(yōu)PAM能使熒光型號增強、縮短檢測時間，那么對靈敏度肯定也是有一些影響的！

  接下來作者進行了一些靈敏度的測試，發(fā)現(xiàn)與標準PAM相比，次優(yōu)PAM靈敏度也能提高10-100倍。

  作者用實際樣本人巨細胞病毒也做了靈敏度測試，同時與QPCR進行靈敏度對比，靈敏度優(yōu)于Qpcr10倍。

 熒光曲線檢測靈敏度高是否同樣肉眼可觀察呢，作者進行了應(yīng)用拓展，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)15-20分鐘肉眼判讀靈敏度為24cp/反應(yīng)，與Qpcr的靈敏度是一致的。
同時也做了膠體金試紙條檢測，靈敏度與熒光相比，略差。

 
作者前端做的所有的實驗都是用MIRA試劑盒進行的，他們也考慮到此方法是否適用其他的恒溫擴增試劑盒呢，就做了安普未來試劑盒與TwistDx試劑盒對比:

  前端基礎(chǔ)擴增靈敏度測試幾乎無差異，但安普未來試劑盒電泳數(shù)據(jù)條帶更清晰明亮；

  又進行了恒溫擴增+Cas12a一管法檢測，結(jié)果我們的試劑盒在靈敏度和熒光檢測強度方面均優(yōu)于TwistDx試劑盒。

  最終得出結(jié)論：MIRA試劑與Cas12a緩沖環(huán)境兼容性更好。

建立的sPAMC檢測方法與其他檢測方法進行了對比，優(yōu)勢在于；一管法的反應(yīng)，不需要其他條件限制靈敏度較高，達1cp/ul，反應(yīng)時間較短15-20min。

  整個文章講下來作者是做了大量的實驗驗證，并且做的結(jié)果也比較好，總結(jié)下來有以下幾點：1、靈敏度高、檢測時間短，實際項目測試了人巨細胞病毒、新冠病毒，靈敏度與QPCR相當、檢測時間在10-15min。
 作者也著重驗證了我們試劑與cas蛋白的兼容性更好。

 

第二篇文章是《MIRA結(jié)合cas13a雙重膠體金試紙條檢測》，希望能給我們后續(xù)的研究帶來一些啟發(fā)。

實驗流程：核酸提取 → MIRA基礎(chǔ)擴增富集底物 → T7轉(zhuǎn)錄酶將雙鏈DNA轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA，cas13a-crRNA復(fù)合體識別并激活切割活性 → 切割報告探針（熒光檢測/試紙條檢測）

  檢測體系的優(yōu)化，除了之前一直強調(diào)的MIRA前端恒溫擴增引物篩選之外，CRISPR體系也有一些優(yōu)化，首先需要篩選crRNA，從結(jié)果可以看到不同crRNA序列對檢測也會有一定影響。此處選擇新冠N基因，N-8作為最優(yōu)crRNA。

 

CRISPR熒光檢測方法條件優(yōu)化

  • 探針選擇：probe1

  • MgCl 2的終濃度：20uM

  • T7 RNA聚合酶：1.5U/uL

  • RNase抑制劑：0.8U/uL

  • �；撬幔�10uM

  • MIRA引物濃度：5uM

  作者雙重膠體金試紙條的檢測原理是我們比較關(guān)注的地方，同時也可能會跟我們提供一些新的思路：

    T線檢測N基因，C2線作為檢測內(nèi)參的質(zhì)控線，

  這里N基因由MIRA擴增后被cas13a識別并切割，T線檢測，靈敏度高；

  內(nèi)參基因由MIRA擴增，擴增產(chǎn)物攜帶地高辛、TAMRA，由C2線檢測；

  引入內(nèi)參的意義在于，保證樣本有效性，防止假陰。

那么此設(shè)計檢出結(jié)果如何呢？

  雙重試紙條結(jié)果顯示，靈敏度在0.25cp/UL，且無交叉反應(yīng)，特異性較好。

  同時也做了熒光型檢測，靈敏度也在0.25cp/UL，且無交叉反應(yīng)，特異性較好。

  最終文章研究意義在于：靈敏度較高、可以做早篩判定、確保樣本的有效性，同時此免疫層析的方法，不需要配合儀器使用，降低成本，在簡單的環(huán)境下就能進行。