WGBS等揭示丹參甲基化表征及DNA甲基化在丹參酮生物合成中的調(diào)控機制

丹參（Salvia miltiorrhiza，S. miltiorrhiza）是一種具有重要經(jīng)濟價值和藥用價值的模式藥用植物，丹參的根會合成一組稱為丹參酮（tanshinone）的二萜類親脂性生物活性成分。丹參酮的生物合成和調(diào)控引起廣泛關(guān)注。DNA甲基化變化在調(diào)控植物種子發(fā)育、莖和葉生長、春化、果實成熟和次級代謝等方面發(fā)揮著重要作用。然而丹參的甲基化組尚未得到分析，DNA甲基化在丹參酮合成過程中的調(diào)節(jié)機制仍然未知。

2023年05月31日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所研究員盧善發(fā)團隊在《Hortic. Res.》雜志在線發(fā)表了題為“Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis”的研究論文，該研究利用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）等分析揭示了丹參酮積累與關(guān)鍵酶基因甲基化水平之間的相關(guān)性，并提示CHH甲基化水平在調(diào)控丹參酮生物合成中的意義。
 
標(biāo)題：Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis（丹參的甲基化表征及DNA甲基化在丹參酮生物合成中的調(diào)控機制）
發(fā)表期刊：Horticulture Research      
發(fā)表日期：2023年05月31日    
影響因子：IF 8.7/ 1區(qū)
技術(shù)：全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）、RNA-seq等
樣品及方法：

• S. miltiorrhiza 系 99-3丹參在試驗田自然條件下生長，三月底從兩年生的植物中采集了March_root樣品，7月下旬采集了July_root和July_leaf樣本，收獲的植物樣本立即冷凍在液氮中直到使用。
• BS-seq文庫構(gòu)建與全基因組重亞硫酸鹽測序；亞硫酸鹽測序數(shù)據(jù)比對和甲基化水平計算；差異甲基化分析
• 轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）分析和qRT-PCR檢測
• sRNA測序和分析
• 5-氮雜胞苷（5-Azacytidine）處理和丹參酮分析

摘要
本研究應(yīng)用無偏好性的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析了丹參根和葉的單堿基分辨率DNA甲基化組。比較分析揭示了CG、CHG和CHH序列的差異甲基化模式，以及DNA甲基化與基因和小RNA（sRNA）表達之間的關(guān)聯(lián)。分析結(jié)果表明，低甲基化基因的表達水平較高，24nt sRNA（24-nucleotide sRNA）可能關(guān)鍵性參與丹參RdDM（RNA-directed DNA methylation）通路。DNA甲基化變異分析表明，CHH甲基化是造成差異的主要原因。Go富集分析表明，與March_root相比，hypoCHHDMR下游重疊基因在July_root的二萜生物合成過程顯著富集。丹參酮生物合成相關(guān)酶基因如DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373，在July_root基因啟動子或下游區(qū)域中的CHH甲基化水平低于March_root。與March_root相比，July_root基因表達上調(diào)，DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷的處理顯著促進了丹參酮合成。研究結(jié)果揭示了DNA甲基化通過改變丹參酮關(guān)鍵酶基因啟動子或下游CHH甲基化水平，在丹參酮生物合成中起重要調(diào)控作用。

研究結(jié)果：
（1）丹參DNA甲基化通路相關(guān)基因及整體DNA甲基化模式  

1. 在March_root中1-Mb bins范圍內(nèi)繪制DNA甲基化圖譜。圓周上的單位顯示兆值（Mb）。Track a，TE覆蓋率（5%-18%/Mb）。Track b，基因密度（4-89/Mb）。Track c，CG甲基化水平（1.6%-87%/Mb）。Track d，CHG甲基化水平（1.2%-77.5%/Mb）。Track e，CHH甲基化水平（0.7%–32.6%/Mb）。
2. 基因和TE的CG、CHG和CHH的DNA甲基化水平。
3. 區(qū)域內(nèi)子序列的密度。
4. 區(qū)域內(nèi)子序列的DNA甲基化水平。

（2）DNA甲基化在基因表達中的作用
 

1. 不同基因體（gene body）和2kb周圍區(qū)域的DNA甲基化水平。根據(jù)表達水平將基因分為五組。將基因體和周圍區(qū)域分別等分為20個bin進行甲基化分析。
2. CG、CHG和CHH序列中五個基因組的平均DNA甲基化。
3. 每個基因區(qū)域的低表達基因和高表達基因之間的DNA甲基化比較。1/3表達水平最高的基因中定義為高表達，1/3表達水平最低的基因被定義為低表達。Promoter，上游2kb。Downstream，下游2kb。

（3）sRNA與DNA甲基化的相關(guān)性

1. March_root和July_root中sRNA的長度分布。
2. 24nt sRNA圖譜和10 nt周圍區(qū)域的核苷酸頻率分布。mC為有義鏈上的甲基化胞嘧啶；mC*為反義鏈上的甲基化胞嘧啶。
3. DNA甲基化與24nt sRNA豐度之間的相關(guān)性。ρ：Spearman秩相關(guān)系數(shù)（P<0.001）。
4. 24nt sRNA在March_root和July_root的基因/TE體和2kb周圍區(qū)域的平均豐度（RPM）分布。

（4）不同丹參（S. miltiorrhiza）樣品DNA甲基化變化特征

1. 三個樣本中基因體和周圍區(qū)域的CG、CHG和CHH序列中的DNA甲基化水平。
2. 三個樣本中TE體和周圍區(qū)域的CG、CHG和CHH序列中的DNA甲基化水平。
3. 三個樣本中所有序列的整體甲基化水平。
4. 三個樣本中所有序列mC的整體甲基化水平。
5. 柱狀圖顯示三個樣本中所有三個序列的mC數(shù)量。

（5）DNA甲基化參與萜烯（terpenes）的生物合成和代謝 圖5：與March_root相比，July_root的 hypoDMR相關(guān)基因在生物學(xué)過程顯著富集。啟動子表示啟動子區(qū)域與hypoDMR重疊的基因。Body表示gene body與hypoDMR重疊的基因。Downstream表示下游基因與hypoDMR重疊的基因。
 

1. 丹參酮生物合成的上游通路。包括質(zhì)體中的MEP通路，細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）、過氧化物酶體和線粒體中的MVA通路，以及中間體二磷酸前體的生物合成。其中，MEP通路在1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶(DXS)的催化下合成中間體1-脫氧-D -木酮糖5-磷酸(DXP)、2- C-甲基-D -赤蘚糖醇4-磷酸(MEP)、4-二磷酸胞苷基-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2-磷酸(CDP-ME)、4-二磷酸胞苷基-2- C-甲基-D-赤蘚糖醇2-磷酸(CDP-ME2P)、2-C-甲基-D-環(huán)二磷酸(MEcPP)、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸(HMBPP)和異戊烯基二磷酸(IPP)。分別生成1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構(gòu)酶(DXR)、2- C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶(MCT)、4-二磷酸胞苷基-2- C -甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、2-C -甲基-赤蘚糖醇2,4-環(huán)二磷酸合酶(MDS)、1-羥基-2-甲基-2-丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)和1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸還原酶(HDR)。MVA通路在乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（AACT）、3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA合成酶（HMGS）、3-羥-3-甲基戊四酰-CoA還原酶（HMGR）、甲戊酸激酶（MK）的催化下分別生成中間體3-羥基-3-甲戊二酰輔酶A（HMG-CoA），5-磷酸甲戊酸激酶（PMK）和甲戊酸焦磷酸脫羧酶（MDC）。IPP可以在異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶（IDI）的催化下轉(zhuǎn)化為二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP）。二磷酸前體香葉基香葉基二磷酸（GGPP）的形成在香葉基香葉基二磷酸鹽合酶（GGPPS）的催化下進行。紅色代表DMR相關(guān)基因。
2. 整合基因組Viewer顯示DMR相關(guān)酶基因的DNA甲基化水平

（6）mCHH在關(guān)鍵酶基因啟動子和下游區(qū)域?qū)Φ�參酮生物合成的調(diào)控

1. 丹參酮相關(guān)的二萜生物合成下游通路。紅色代表DMR相關(guān)酶基因。實線箭頭和虛線箭頭分別表示已建立的關(guān)系和假設(shè)的關(guān)系。
2. 綜合基因組學(xué)Viewer顯示DMR相關(guān)酶基因的DNA甲基化水平。

1. 有或沒有5-氮雜胞苷處理的丹參毛狀根表型。
2. 用不同濃度的5-氮雜胞苷處理30d后的丹參毛狀根中二氫丹參酮I（dihydrotanshinone I）、隱丹參酮（cryptotanshinone）、丹參酮I（tanshinone I）和丹參酮IIA（tanshinone IIA）的含量。顯示三次生物學(xué)重復(fù)的平均值。誤差條代表SE。通過單因素方差分析計算5%水平的顯著差異以不同的字母表示。

研究結(jié)論
本研究首次在丹參中繪制了單堿基分辨率的全基因組DNA甲基化圖譜。結(jié)果表明， DNA低甲基化可以上調(diào)丹參的基因表達，24nt sRNA可能是RdDM通路的主要參與者。此外，DMC/DMR分析表明，差異甲基化主要發(fā)生在CHH序列中，與March_root相比，July_root中與hypoCHHDMR相關(guān)的基因在萜烯生物合成過程中富集。最重要的是，在July_root和March_root之間的14個DMR相關(guān)丹參酮生物合成酶基因中，包括DXS2、CMK、IDI1、HMGR2、DXR、MDS、CYP76AH1、2OGD25和CYP71D373在內(nèi)的9個基因在July_root基因啟動子區(qū)或下游區(qū)域表現(xiàn)出CHH低甲基化。進一步的DNA甲基化抑制劑處理促進了丹參毛狀根中丹參酮的生物合成。總之，DNA甲基化可以通過丹參酮生物合成酶基因啟動子和下游的CHH去甲基化來促進丹參酮的生物合成。本研究為丹參酮生物合成的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機制提供了新的見解，將有助于進一步提高丹參活性化合物的產(chǎn)量。

參考文獻：
Li J, Li C, Deng Y, Wei H, Lu S. Characteristics of Salvia miltiorrhiza methylome and the regulatory mechanism of DNA methylation in tanshinone biosynthesis. Hortic Res. 2023 Jul;10(7):uhad114.