MeRIP-seq揭示mRNA m6A甲基化調(diào)控?cái)M南芥的抗寒性分子機(jī)制中的應(yīng)用
植物通過(guò)改變數(shù)千個(gè)基因的mRNA豐度以促進(jìn)其生理和代謝過(guò)程，從而對(duì)低溫應(yīng)激進(jìn)行響應(yīng)。在轉(zhuǎn)錄后水平上，這些冷應(yīng)激應(yīng)答轉(zhuǎn)錄本經(jīng)歷可變剪接、microRNA介導(dǎo)的調(diào)控和可變多腺苷酸化等。最近研究表明，m6A、m5C等RNA修飾可以影響RNA調(diào)控和鑒定mRNA修飾穩(wěn)定性，從而揭示了另一層在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。m6A在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性已經(jīng)得到了重視，但m6A在脅迫條件下的重要性仍未得到充分探討，因此m6A修飾在冷脅迫條件下的應(yīng)激機(jī)制研究具有非常重要意義。
2022年8月，美國(guó)俄克拉荷馬州立大學(xué)Ramanjulu Sunkar團(tuán)隊(duì)和賓夕法尼亞大學(xué)Brian D. Gregory團(tuán)隊(duì)合作以“mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis”為題在《the plant journal 》雜志發(fā)表研究論文，該研究以擬南芥為對(duì)象，通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）揭示了表觀轉(zhuǎn)錄組（m6A甲基化）在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。
標(biāo)題：mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis（mRNA N6-甲基腺苷對(duì)擬南芥的抗寒性至關(guān)重要）
時(shí)間：2022-08
期刊：the plant journal
影響因子：IF 7.2
技術(shù)平臺(tái)：m6A-seq（MeRIP-seq）、polysomal-seq（翻譯組）、qRT-PCR、Dot-blot等
研究摘要：
本研究為了檢測(cè)m6A修飾在冷脅迫應(yīng)激響應(yīng)中的作用，對(duì)冷脅迫（chilling stress）（4°C）24小時(shí)的擬南芥幼苗中進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq），在轉(zhuǎn)錄組范圍進(jìn)行m6A甲基化分析，分析揭示了m6A修飾在低溫脅迫下的大范圍變化。由于已知m6A會(huì)影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性/降解和翻譯，本研究分析了這些可能性，分析結(jié)果表明在冷脅迫下，冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本在冷脅迫下表現(xiàn)出mRNA豐度的最大增加，同時(shí)核糖體（ribosome）率增加。利用m6A甲基轉(zhuǎn)移酶主要基因突變的mta突變體進(jìn)一步評(píng)估m(xù)6A表觀轉(zhuǎn)錄組對(duì)植物抗寒性的意義。與野生型相比，隨著CBF和COR基因表達(dá)水平的差異，mta突變體對(duì)冷處理表現(xiàn)出超敏反應(yīng)，這由根的初生生長(zhǎng)、生物量和活性氧積累決定。此外，非馴化和冷馴化的mta突變體都表現(xiàn)出對(duì)抗冷凍的超敏反應(yīng)�？傊�，本研究表明了表觀轉(zhuǎn)錄組在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。
研究結(jié)果
（1）MeRIP-seq鑒定在冷脅迫下m6A富集或m6A缺失的轉(zhuǎn)錄本
圖1：擬南芥m6A表現(xiàn)出3′UTR位點(diǎn)偏倚，對(duì)冷脅迫無(wú)響應(yīng)的peaks偏倚更強(qiáng)。
（a） 冷處理樣品和對(duì)照處理樣品的生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行重疊獲得的高置信度m6A peaks分析鑒定出5829個(gè)對(duì)照富集（冷缺失）peaks、1318個(gè)冷富集m6A peaks和11個(gè) 943個(gè)共有peaks（未改變）。
（b） MeRIP-seq reads沿分類轉(zhuǎn)錄本的分布。
（c） 通過(guò)homer鑒定的RNA motif在目標(biāo)m6A peaks區(qū)域中富集。
（d） 與5′UTR、起始密碼子、CDS、終止密碼子和3′UTR重疊的冷富集、對(duì)照富集和共有m6A peaks的百分比分布。
（e） 轉(zhuǎn)錄本的冷富集、對(duì)照富集和共有m6A peaks起始和終止密碼子周圍區(qū)域甲基化的核苷酸水平。每個(gè)組都被標(biāo)準(zhǔn)化為其在該區(qū)域中的最大值
（2）冷應(yīng)激誘導(dǎo)大范圍轉(zhuǎn)錄組變化
（b）在冷脅迫期間顯著增加或減少的轉(zhuǎn)錄本相關(guān)的GO分析熱圖
（c） 冷處理和對(duì)照條件下mRNA豐度的倍數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄本的冷處理和對(duì)照組中富集m6A peaks的差異及共有分析
（3）冷富集m6A peaks的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出多聚體結(jié)合增加
（b）對(duì)冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本的peaks GO分析的生物功能分類。
（c） 基因組瀏覽器視圖（Genome browser views）分析比較主要已知冷調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的meRIP-seq（標(biāo)記為m6A）、mRNA-seq（標(biāo)為mRNA）和多聚體分析（polysome profiling，標(biāo)記為Ps-seq）。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄的方向。
（4）mta突變體植株對(duì)冷脅迫表現(xiàn)出超敏反應(yīng)
圖4：與Col-0植株相比，mta突變體的冷響應(yīng)揭示了mRNA豐度和多聚體負(fù)載差異。
（a）qPCR方法檢測(cè)與Col-0植物相比，對(duì)照和冷條件下MTA突變體中MTA轉(zhuǎn)錄本的相對(duì)mRNA水平。
（b）與Col-0植株相比，mta突變體的表型檢測(cè)和冷響應(yīng)定量分析，
（c）根長(zhǎng)（對(duì)照幼苗在22°c下生長(zhǎng)10 天，而在冷處理下幼苗生長(zhǎng)了52天）
（d）鮮重。
（e） 長(zhǎng)期低溫脅迫后葉片組織中ROS的積累情況。
圖5：通過(guò)電解質(zhì)滲漏測(cè)定法（electrolyte leakage assay）分析mta突變體對(duì)冷凍脅迫響應(yīng)的敏感性。
對(duì)5周齡的未馴化（NA）（a）和冷馴化（CA，4°C，7 天）（b）的Col-0和mta突變體植株進(jìn)行電解質(zhì)滲漏檢測(cè)分析。✳表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P<0.05，t檢驗(yàn)）。
（5）冷脅迫下mta突變體的CBF和COR基因表達(dá)水平
參考文獻(xiàn)：
Govindan G, Sharma B, Li YF, Armstrong CD, Merum P, Rohila JS, Gregory BD, Sunkar R. mRNA N6 -methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis. Plant J. 2022 Aug;111(4):1052-1068.
2022年8月，美國(guó)俄克拉荷馬州立大學(xué)Ramanjulu Sunkar團(tuán)隊(duì)和賓夕法尼亞大學(xué)Brian D. Gregory團(tuán)隊(duì)合作以“mRNA N6-methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis”為題在《the plant journal 》雜志發(fā)表研究論文，該研究以擬南芥為對(duì)象，通過(guò)甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq）揭示了表觀轉(zhuǎn)錄組（m6A甲基化）在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。
時(shí)間：2022-08
期刊：the plant journal
影響因子：IF 7.2
技術(shù)平臺(tái)：m6A-seq（MeRIP-seq）、polysomal-seq（翻譯組）、qRT-PCR、Dot-blot等
研究摘要：
本研究為了檢測(cè)m6A修飾在冷脅迫應(yīng)激響應(yīng)中的作用，對(duì)冷脅迫（chilling stress）（4°C）24小時(shí)的擬南芥幼苗中進(jìn)行了甲基化RNA免疫沉淀測(cè)序（MeRIP-seq），在轉(zhuǎn)錄組范圍進(jìn)行m6A甲基化分析，分析揭示了m6A修飾在低溫脅迫下的大范圍變化。由于已知m6A會(huì)影響轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性/降解和翻譯，本研究分析了這些可能性，分析結(jié)果表明在冷脅迫下，冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本在冷脅迫下表現(xiàn)出mRNA豐度的最大增加，同時(shí)核糖體（ribosome）率增加。利用m6A甲基轉(zhuǎn)移酶主要基因突變的mta突變體進(jìn)一步評(píng)估m(xù)6A表觀轉(zhuǎn)錄組對(duì)植物抗寒性的意義。與野生型相比，隨著CBF和COR基因表達(dá)水平的差異，mta突變體對(duì)冷處理表現(xiàn)出超敏反應(yīng)，這由根的初生生長(zhǎng)、生物量和活性氧積累決定。此外，非馴化和冷馴化的mta突變體都表現(xiàn)出對(duì)抗冷凍的超敏反應(yīng)�？傊�，本研究表明了表觀轉(zhuǎn)錄組在擬南芥抗寒性中的關(guān)鍵作用。
研究結(jié)果
（1）MeRIP-seq鑒定在冷脅迫下m6A富集或m6A缺失的轉(zhuǎn)錄本
圖1：擬南芥m6A表現(xiàn)出3′UTR位點(diǎn)偏倚，對(duì)冷脅迫無(wú)響應(yīng)的peaks偏倚更強(qiáng)。
（b） MeRIP-seq reads沿分類轉(zhuǎn)錄本的分布。
（c） 通過(guò)homer鑒定的RNA motif在目標(biāo)m6A peaks區(qū)域中富集。
（d） 與5′UTR、起始密碼子、CDS、終止密碼子和3′UTR重疊的冷富集、對(duì)照富集和共有m6A peaks的百分比分布。
（e） 轉(zhuǎn)錄本的冷富集、對(duì)照富集和共有m6A peaks起始和終止密碼子周圍區(qū)域甲基化的核苷酸水平。每個(gè)組都被標(biāo)準(zhǔn)化為其在該區(qū)域中的最大值
（2）冷應(yīng)激誘導(dǎo)大范圍轉(zhuǎn)錄組變化
圖2：低溫脅迫24小時(shí)后的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果表明，已知的主要冷響應(yīng)基因的mRNA豐度增加。
（a）與對(duì)照Col-0植株相比，低溫處理植株的整體冷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄組變化MA圖。紅點(diǎn)代表RNA豐度變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的轉(zhuǎn)錄本（調(diào)整P<0.05），灰色表示沒(méi)有變化的轉(zhuǎn)錄本。藍(lán)點(diǎn)突出顯示已知與植物冷脅迫響應(yīng)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本。（b）在冷脅迫期間顯著增加或減少的轉(zhuǎn)錄本相關(guān)的GO分析熱圖
（c） 冷處理和對(duì)照條件下mRNA豐度的倍數(shù)變化與轉(zhuǎn)錄本的冷處理和對(duì)照組中富集m6A peaks的差異及共有分析
（3）冷富集m6A peaks的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出多聚體結(jié)合增加
圖3：冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本的peaks對(duì)冷處理表現(xiàn)出更高的mRNA豐度和核糖體占有率
（a） 對(duì)照處理和冷處理之間轉(zhuǎn)錄本的核糖體占有差異，比較只冷處理和只對(duì)照中轉(zhuǎn)錄組富集m6A peaks之間的差異，以及在兩種條件下的共有差異。（b）對(duì)冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本的peaks GO分析的生物功能分類。
（c） 基因組瀏覽器視圖（Genome browser views）分析比較主要已知冷調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的meRIP-seq（標(biāo)記為m6A）、mRNA-seq（標(biāo)為mRNA）和多聚體分析（polysome profiling，標(biāo)記為Ps-seq）。箭頭表示基因轉(zhuǎn)錄的方向。
（4）mta突變體植株對(duì)冷脅迫表現(xiàn)出超敏反應(yīng)
圖4：與Col-0植株相比，mta突變體的冷響應(yīng)揭示了mRNA豐度和多聚體負(fù)載差異。
（b）與Col-0植株相比，mta突變體的表型檢測(cè)和冷響應(yīng)定量分析，
（c）根長(zhǎng)（對(duì)照幼苗在22°c下生長(zhǎng)10 天，而在冷處理下幼苗生長(zhǎng)了52天）
（d）鮮重。
（e） 長(zhǎng)期低溫脅迫后葉片組織中ROS的積累情況。
對(duì)5周齡的未馴化（NA）（a）和冷馴化（CA，4°C，7 天）（b）的Col-0和mta突變體植株進(jìn)行電解質(zhì)滲漏檢測(cè)分析。✳表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P<0.05，t檢驗(yàn)）。
（5）冷脅迫下mta突變體的CBF和COR基因表達(dá)水平
圖6：qPCR分析表明，冷富集m6A轉(zhuǎn)錄本與RNA豐度以及核糖體占有率之間存在潛在相關(guān)性。在Col-0和mta中，候選CBF和COR基因的相對(duì)mRNA豐度和多聚體負(fù)載的變化通過(guò)對(duì)照和低溫條件下的倍數(shù)變化來(lái)分析。
參考文獻(xiàn)：
Govindan G, Sharma B, Li YF, Armstrong CD, Merum P, Rohila JS, Gregory BD, Sunkar R. mRNA N6 -methyladenosine is critical for cold tolerance in Arabidopsis. Plant J. 2022 Aug;111(4):1052-1068.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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