WGBS等揭示DNA甲基化調(diào)控林地草莓植株高度和果實大小的分子機制

DNA甲基化影響基因組穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)座子沉默和基因表達；它主要發(fā)生在對稱CG和CHG以及不對稱CHH (H = A, C或T)中的胞嘧啶上。RNA介導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation，RdDM)通路調(diào)控植物中所有三種序列背景下的novo DNA甲基化。RdDM通路非常復(fù)雜，由許多蛋白質(zhì)和非編碼RNA組成。盡管RdDM是一種重要的表觀遺傳修飾通路，但其生物學(xué)作用和進化重要性僅局限于少數(shù)植物物種。在RdDM機制中，小基因家族DNA甲基化因子(FDM) 1-5及其參與De Novo 2 (IDN2)/RDM 12的同源物是重要的組成部分。
 
草莓是世界各地種植的一種受歡迎水果作物。栽培草莓屬于八倍體物種Fragaria X ananassa。二倍體林地草莓Fragaria vesca（F. vesca）是栽培草莓的祖先種，是經(jīng)常被用作基礎(chǔ)研究的模式物種。在栽培草莓果實成熟過程中，由于RdDM活性降低，檢測到整體DNA甲基化減少。然而，關(guān)于DNA甲基化對草莓其他性狀的調(diào)控作用知之甚少。
 
2022年10月6日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院康春英教授團隊以“Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation”為題在《Plant Physiology》雜志發(fā)表研究論文。該研究以林地草莓 (F. vesca)為對象，通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）的表觀基因組和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組分析，揭示了DNA甲基化因子1（FDM1）通過調(diào)控CHH中的DNA甲基化，在啟動子和3’-末端位點具有更強作用，并影響不同組織中的基因表達，改變DNA甲基化水平，從而影響林地草莓的植株高度和果實大小，表明了RdDM在草莓生長發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控作用。
  標(biāo)題：Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation （DNA甲基化因子1通過DNA甲基化影響林地草莓植株的生長和果實大小）
時間：2022-10-06
期刊：Plant Physiology
影響因子：IF 7.4 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：WGBS、RNA-seq、qRT-PCR分析等

研究摘要：
RNA介導(dǎo)的DNA甲基化（RdDM）是一種表觀遺傳學(xué)過程，RdDM將沉默導(dǎo)向特定的基因組區(qū)域和位點。RdDM生物學(xué)功能在園藝植物中沒有得到深入研究。本研究在林地草莓（Fragaria vesca）分離了EMS（ethyl methane-sulfonate）誘導(dǎo)的（reduced organ size，ros）突變體，與野生型（WT）相比，ros突變體由于細胞數(shù)量減少，會產(chǎn)生小的葉片、花朵和果實。候選突變導(dǎo)致FvH4_6g28780中的過早終止密碼子，該密碼子與編碼RdDM通路成分的擬南芥（Arabidopsis thaliana）DNA甲基化因子1（FDM1）具有高度相似性，被命名為FveFDM1。同樣，CRISPR/Cas9產(chǎn)生的fvefdm1CR突變體也產(chǎn)生較小的果實。在擬南芥fdm1-1fdm2-1雙突變體中過表達FveFDM1回復(fù)了RdDM靶位點的DNA甲基化。FveFDM1與De Novo 2（FveIDN2）中參與的同源物在蛋白質(zhì)復(fù)合體中發(fā)揮作用。

全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）顯示，fvefdm1的全基因組DNA甲基化顯著減少，尤其在CHH中。與野生型(WT)組織相比，fvefdm1突變體的不同組織中鑒定出共有和特異性差異表達基因，驗證了幾種赤霉素（GA）生物合成和細胞周期基因的DNA甲基化和表達水平。與WT相比，fvefdm1幼葉中GA和生長素含量顯著降低，且經(jīng)外源GA和生長素處理也不能恢復(fù)fvefdml的果實器官大小。此外，GA處理大大誘導(dǎo)了FveFDM1、FveIDN2、核RNA聚合酶D1（FveNRPD1）、結(jié)構(gòu)域重排甲基化酶2（FveDRM2）和細胞周期基因的表達水平�？傊�，本研究結(jié)果表明了FveFDM1通過RdDM介導(dǎo)的園藝作物DNA甲基化在植物生長和發(fā)育中的關(guān)鍵作用。
  GA誘導(dǎo)FveFDM1和FveIDN2表達，F(xiàn)veFDM1/FveIDN2的蛋白復(fù)合體直接結(jié)合長RNA，與AGO4-siRNA一起影響靶位點的DNA甲基化水平。一些潛在的下游調(diào)控基因被DNA甲基化促進或抑制，通過干擾細胞分裂導(dǎo)致果實器官大小變化。

設(shè)計思路
結(jié)果圖形
（1）F. vesca中的ros突變體在細胞增殖方面存在缺陷 A. WT野生型（F.vesca植株YW）和ros突變體植株。
B. WT野生型和ros突變體的葉片、開放的花朵和成熟的果實。在（A）和（B）中，對各個圖像的數(shù)字提取以比較分析。
C. WT和ros的葉片表皮近軸側(cè)圖像。
D. 葉片表皮的同一區(qū)域的細胞數(shù)量和葉片面積。
E. WT和ros的花瓣表皮的差分干涉對比圖像。
F. 在花瓣表皮的同一區(qū)域的花瓣面積和細胞數(shù)量。
G. WT和ros果實在髓中心7 DAP時的橫截面圖像。
H. 7 DAP時，果實髓同一區(qū)域的細胞數(shù)。

在D、F和H中，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）；n=6-15；**P＜0.01，學(xué)生t檢驗。比例尺：（A）2cm；（B）1cm；（C和G）100 μm；（E） 10 μm。
 
（2）ros突變體由FveFDM1中的點突變誘導(dǎo) A. FveFDM1基因模型和ros致病突變示意圖。粗條表示外顯子，細條表示內(nèi)含子。突變密碼子有下劃線。
B. FveFDM1的保守結(jié)構(gòu)域和突變位點示意圖。
C. FveFDM1及其同源物在草莓、擬南芥和水稻中的系統(tǒng)發(fā)育樹。Bootstrap值來自1000個重復(fù)百分比。藍點表示草莓基因。每個位點比例尺。
D. 基于RNA-seq reads的log2轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)錄本，每M reads顯示FveFDM1及其同源物在F.vesca不同組織中的表達水平熱圖。SAM，莖尖分生組織；FM，花分生組織；REM，花托分生組織；RG，F(xiàn). vesca變種Ruegen；YW，F(xiàn).vesca品種YW。
E. FveFDM1-GFP、FveIDN2-GFP和FveFDM2-GFP在N. benthamiana葉片中的亞細胞定位。比例尺：10 μm。

（3）CRISPR/Cas9敲除FveFDM1導(dǎo)致果實器官變小 A. FveFDM1中sgRNA靶位點示意圖。原間隔區(qū)相鄰motif（PAM）序列用紅色表示。
B. T0代中的三個fvefdm1^CR突變體（L1-3）和未經(jīng)編輯的轉(zhuǎn)化植物（WT）。
C. 在T0代中fvefdm1^CR L1–3的sgRNA靶位點誘導(dǎo)突變。虛線表示敲除的核苷酸。插入的核苷酸用紅色表示。所有測序克隆中每個等位基因比例在序列后面表示。
D. fvefdm1^CR L1–3和WT的成熟葉片。
E. fvefdm1^CR L1–3和WT的葉片大小。對單個圖像進行數(shù)字提取以進行比較。
F. fvefdm1^CR L1–3和WT葉片表皮近軸側(cè)的圖像。
G. fvefdm1^CR L1–3和WT葉片表皮近軸側(cè)的細胞數(shù)量和細胞大小。
H. FveFDM1在fvefdm1^CR L1–3和WT幼葉中的表達水平。
數(shù)據(jù)為從三個生物學(xué)重復(fù)中獲得的平均值±SD；*P＜0.05；**P＜0.01，學(xué)生t檢驗。比例尺：（B和D）2 cm；（F）100μm。

（4）FveFDM1在RdDM通路中起作用，并與FveIDN2直接互作 A. RT–qPCR檢測FveFDM1在fdm1-1 fdm2-1和三個FveFDM1-ox轉(zhuǎn)基因系（L8、L15和L16）中的表達水平。
B. WT、fdm1-1、fdm2-1和三個轉(zhuǎn)基因系葉片中，通過HaeIII或McrBC和qPCR消化的chop PCR檢測三個RdDM靶標(biāo)AtSN1、IGN5和siR02的DNA甲基化水平。使用未消化的基因組DNA作為每個樣品對照擴增。（A）和（B）中的數(shù)據(jù)從三個生物學(xué)重復(fù)中獲得的平均值±SD；**P＜0.01，學(xué)生t檢驗。
C. 通過酵母雙雜交分析檢測FveFDM1、FveIDN2和FveFDM2之間的蛋白質(zhì)互作。轉(zhuǎn)化的酵母細胞在SD–Leu–Trp或SD–Leu-Trp–His–Ade培養(yǎng)基上生長。AD：激活域；BD：DNA結(jié)合域。使用空載體作為對照。
D. 利用分裂熒光素酶互補法檢測N. benthamiana葉片中FveFDM1和FveIDN2之間的蛋白質(zhì)互作。比例尺：2 cm.
E. Co-IP檢測FveFDM1和FveIDN2之間的蛋白質(zhì)互作。該蛋白在N.benthamiana葉片中瞬時表達。

（5）FveFDM1調(diào)控DNA甲基化 A. F.vesca WT和fvefdm1中所有基因和TE中CG、CHG和CHH甲基化的平均水平，包括轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游2kb和轉(zhuǎn)錄終止位點（TTS）下游2kb。
B. fvefdm1中CG、CHG和CHH中相對于WT的hyper-DMR和hypo-DMR數(shù)量。
C. WT和fvefdm1中hypo-DMR中的CG、CHG和CHH甲基化水平方框圖。Center line, median; box limits, upper and lower quartiles; whiskers,1.5 X interquartile range; points, outliers.（A）和（C）設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。
D. CG、CHG和CHH 中hypo-DMR的基因組分布。N（CG-hypo-DMR）=13563，n（CHG-hypo-DMR）=43141，n（CH-hypo-deMR）=74720。
E. CHH hypo-DMR在不同基因組區(qū)域分布。Promoter表示TSS上游2kb。Downstream表示TTS的下游2kb。
F. WT和fvefdm1中與基因組比對的小RNA的大小分布。數(shù)據(jù)表示為三個生物重復(fù)的平均值±SD。
G. 下調(diào)（downregulated）（n=23395）或隨機（random）（n=233 95）siRNA簇與CHH-hypo-DMR重疊或不重疊的百分比。**P＜0.01，F(xiàn)isher精確檢驗。

（6）FveFDM1突變導(dǎo)致的差異表達基因 A. 與WT相比，fvefdm1的莖尖、花和果實中特異性和共有的差異表達基因（DEG）Venn圖（倍數(shù)變化＞2，P＜0.01＝。
B. 與WT相比，fvefdm1花朵中CG、CHG和CHH環(huán)境下DEG的DNA甲基化變化熱圖（fvefdm1-WT）。
C. 在果實器官大小中具有潛在調(diào)控作用的候選DEG的log2轉(zhuǎn)化倍數(shù)變化熱圖。
D. RT–qPCR檢測三種共有上調(diào)基因在莖尖、花和果實中的表達水平。
E. 幼葉中三個共有上調(diào)基因的DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。
F. RT–qPCR檢測細胞周期基因在莖尖的表達水平。
G. 幼葉細胞周期基因DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。
H. RT-qPCR檢測7 DAP時果實中GA生物合成和分解代謝基因的表達水平。
I. 7 DAP時果實GA生物合成和分解代謝基因DNA甲基化水平的McrBC-qPCR分析。
在（E、G和I）中，對McrBC消化的基因組DNA進行qPCR，其中高qPCR信號表示較低的mC水平。以GAPDH（FvH4_4g24420）中沒有DNA甲基化片段作為對照。（D-I）中的數(shù)據(jù)從三個生物學(xué)重復(fù)中獲得的平均值±SD；**P＜0.01，學(xué)生t檢驗。

（7）FveFDM1介導(dǎo)的RdDM通路與GA和生長素互作 A. WT和fvefdm1幼葉中GA和生長素的含量。
B. GA 3處理2周后WT和fvefdm1葉片圖像。比例尺:1 cm。
C. GA 3處理2周后WT和fvefdm1的葉柄長度和葉片面積。
D. GA 3 + NAA處理1個月后WT和fvefdm1未授粉果實的圖像。比例尺：1cm。在(B)和(D)中，對單個圖像進行數(shù)字提取以進行比較。
E. GA 3 + NAA處理1個月后WT和fvefdm1未授粉果實的寬度和長度。
F. GA 3處理24h后WT幼苗中FveFDM1及其他三個RdDM基因的表達水平。
G. GA 3處理24 h后WT幼苗細胞周期基因的表達水平。柱狀圖數(shù)據(jù)為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±SD;** P＜0.01，學(xué)生t檢驗。

參考文獻：
Zheng G, Hu S, Cheng S, Wang L, Kan L, Wang Z, Xu Q, Liu Z, Kang C. Factor of DNA methylation 1 affects woodland strawberry plant stature and organ size via DNA methylation. Plant Physiol. 2023 Jan 2;191(1):335-351. pii: 6749584.