噬菌體展示技術(shù)的基本原理

一．噬菌體展示技術(shù)的原理

噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置，在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下，使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達，融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經(jīng)繁殖擴增，進行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪-5輪的“吸附-洗脫-擴增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。

二．常用的噬菌體展示系統(tǒng)-單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)

（1）PIII展示系統(tǒng)

絲狀噬菌體是單鏈DNA病毒，PI是病毒的次要外殼蛋白，位于病毒顆粒的尾端，是噬菌體感染大腸埃希菌所必須的。每個病毒顆粒都有3個-5個拷貝PI蛋白，其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個功能區(qū)域，這3個功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中，N1和N2與噬菌體吸附大腸埃希菌菌毛及穿透細胞膜有關(guān)，而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分，并將整個PI蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。PII有2個位點可供外源序列插入，當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于PI蛋白的信號肽（SgII）和N1之間時，該系統(tǒng)保留了完整的PI蛋白，噬菌體仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接與PI蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連，則噬菌體喪失感染性，這時重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達的完整PI蛋白來提供。PI蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有輔助噬菌體超感染時，可以使每個噬菌體平均展示不到一個融合蛋白，即所謂“單價”噬菌體。

（2）PVIII展示系統(tǒng)

PVI是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白，位于噬菌體外側(cè)，C端與DNA結(jié)合，N端伸出噬菌體外，每個病毒顆粒有2700個左右PV拷貝。PVM的N端附近可融合五肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配，使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PVI蛋白，降低價數(shù)，此時可融合多肽甚至抗體片段。此外，尚有絲狀噬菌體PVI展示系統(tǒng)的研究報道。PVI蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點，可以用于研究外源蛋白C端結(jié)構(gòu)區(qū)域功能。

三．PIII和PVIII的區(qū)別

絲狀噬菌體展示系統(tǒng)一般是在包膜蛋白pIII或pVIII的N端融合外源多肽。每個病毒子含５個拷貝的pIII蛋白，這五個蛋白都可以融合短肽而不影響噬菌體的感染力。而對主要包膜蛋白pVIII來說，每個病毒子含約2700個拷貝之多，其中約10%能有效地融合外源多肽或蛋白。以pIII融合子方式表達的多肽便是低價的（每個病毒子1~5個拷貝），而以pVIII融合子方式表達的多肽則是高價的（每個病毒子~200個拷貝）。這種高價pVIII展示所增加的親和力／性有利于篩選到親和力非常低的配體，而低價pIII展示則將篩選限制在具有較高親和力的配體上。

四．M13噬菌體的優(yōu)點

M13噬菌體和與其密切相關(guān)的絲狀噬菌體fd和f1均為非裂解性噬菌體，它們在增殖期間均不裂解宿主菌。這就極大地簡化了每輪淘選過程之間的中間噬菌體純化步驟，只用簡單的PEG沉淀方法就足以將噬菌體與其他所有污染的細胞蛋白分開。而其他用于噬菌體展示的噬菌體，如T7，T4和Lambda噬菌體，均為裂解性噬菌體，每輪淘選之間都需要花時間進行純化，以避免淘選擴增的噬菌體污染有細胞蛋白。