細(xì)菌微生物基因表達(dá)調(diào)控表觀研究方案之原核三代甲基化及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

原核甲基化

• 原核生物中的DNA甲基化

 
Ø  原核生物甲基化為什么基于三代測(cè)序？
 第三代DNA測(cè)序?yàn)樵�核�?xì)菌的甲基化和表觀遺傳的研究開辟了一條新的途徑，能夠在基因組的水平上獲取整個(gè)表觀遺傳的序列信息，繪制全基因組甲基化組。
Ø  細(xì)菌全基因組甲基化納米孔測(cè)序(ONT)

• 技術(shù)路線

 

• 技術(shù)優(yōu)勢(shì)
  • 平均讀長(zhǎng)＞10Kbp，最長(zhǎng)可達(dá)2M左右，直接跨越重復(fù)序列、高度多態(tài)性區(qū)域等特殊區(qū)域；
  • 無(wú)需PCR擴(kuò)增，可直接保留并檢測(cè)DNA甲基化修飾；
  • 可同時(shí)檢測(cè)全基因組范圍單堿基的5mC與6mA修飾位點(diǎn)，并給出單堿基的甲基化水平；
  • ONT測(cè)序成本相對(duì)于二代NGS測(cè)序技術(shù)大幅降低。

原核轉(zhuǎn)錄組（mRNA+sRNA）
原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以從基因表達(dá)量、基因結(jié)構(gòu)和sRNA調(diào)控功能三維度揭示不同生物性狀的分子調(diào)控機(jī)制。如通過計(jì)算各組間的差異基因并對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析，獲得對(duì)生物性狀影響較大的通路信息；通過預(yù)測(cè)基因的反義轉(zhuǎn)錄本，豐富基因組注釋內(nèi)容；研究sRNA對(duì)mRNA的相互作用，從分子調(diào)控角度解釋生物性狀之間的差異。



Ø  細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄組研究意義
轉(zhuǎn)錄技術(shù)在原核生物轉(zhuǎn)錄組研究上的突破，已經(jīng)顯示出其在揭示原核生物生命過程的分子機(jī)制上獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。對(duì)原核生物的轉(zhuǎn)錄組研究開始于致病菌，但不止步于致病菌。近年來(lái)，原核轉(zhuǎn)錄組已成為一種普遍的研究方法，而通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析環(huán)境脅迫、抗菌藥物、生防細(xì)菌處理下的原核生物更早已成為研究熱點(diǎn)。
l   基因表達(dá)量分析
l   差異基因鑒定

• 非編碼RNA鑒定等

Ø  原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(mRNA+sRNA)
易基因?qū)＠�技術(shù)：針對(duì)檢測(cè)原核菌個(gè)性化設(shè)計(jì)rRNA去除探針，利用高通量技術(shù)對(duì)原核細(xì)胞所產(chǎn)生的所有mRNA和sRNA（非編碼RNA）進(jìn)行測(cè)序。系統(tǒng)全面解析特定細(xì)胞所產(chǎn)生的mRNA和sRNA對(duì)生物性狀的影響。

• 技術(shù)路線

• 技術(shù)優(yōu)勢(shì)

針對(duì)原核生物設(shè)計(jì)去除rRNA專屬探針，rRNA去除效果好。
同時(shí)分析sRNA與mRNA的互作關(guān)系，更加全面解讀表達(dá)互作網(wǎng)絡(luò)。




原核甲基化+轉(zhuǎn)錄組組學(xué)關(guān)聯(lián)分析
原核甲基化+轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析可同時(shí)實(shí)現(xiàn)從“因”和“果”兩個(gè)層面研究生物學(xué)問題，串聯(lián)證據(jù)，并對(duì)其相關(guān)性進(jìn)行驗(yàn)證，從不同的角度合力探索和解釋生物學(xué)問題。
判斷組學(xué)之間是否可以進(jìn)行關(guān)聯(lián)：是否有關(guān)聯(lián)的生物學(xué)理論基礎(chǔ)？
如：
• 啟動(dòng)子區(qū)甲基化會(huì)抑制基因的表達(dá)；
• 基因主體甲基化與基因表達(dá)正相關(guān)等。
因果關(guān)系的論證一般需要嚴(yán)密的分子實(shí)驗(yàn)。

研究案例

• 原核甲基化研究案例

痤瘡表皮桿菌噬菌體表觀遺傳印跡的工程選擇性研究 影響因子：IF 6.7
技術(shù)平臺(tái)：原核甲基化測(cè)序分析
實(shí)驗(yàn)樣本：痤瘡表皮桿菌(C. acnes)
研究背景：
痤瘡桿菌（C.acnes）是一種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，是人類皮膚微生物組成員。盡管是最豐富的皮膚共生體，但某些成員與常見的炎癥性疾�。ㄈ琊畀彛┯嘘P(guān)。各種C.acnes分支的完整基因組序列可以鑒定推定的甲基轉(zhuǎn)移酶，其中一些可能屬于保護(hù)入侵DNA宿主的限制性修飾（R-M）系統(tǒng)。然而，關(guān)于這些系統(tǒng)是否在不同的C.acnes菌株中起作用，目前知之甚少。
 
研究結(jié)果：
在菌株KPA171202中確定的DNA共有序列上檢測(cè)到6mA修飾，且該R-M系統(tǒng)的重組表達(dá)證實(shí)了其甲基化活性，而R-M敲除突變體驗(yàn)證了該菌株甲基化特性的缺失。此外還研究了C. acnes噬菌體（PAD20）殺死各種C. acnes菌株的潛力，并將其特異性的增加與甲基化敏感株獲得的噬菌體DNA甲基化聯(lián)系起來(lái)。研究證明R-M缺失菌株中繁殖的噬菌體選擇性地殺死R-M缺失痤瘡敏感分支，而益生菌保持對(duì)噬菌體感染的抗性。 圖1：C.acnes KPA171202（SLST H2）具有在AGCAGY序列甲基化motif的功能性R-M系統(tǒng)。


圖2：C.acnes KPA171202的R-M系統(tǒng)IIIB影響PAD20噬菌體感染性狀并保護(hù)細(xì)菌免受裂解。

 

• 原核轉(zhuǎn)錄組研究案例

原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析揭示微藻對(duì)鎘脅迫的短期和長(zhǎng)期響應(yīng)分子機(jī)制
文章期刊：CHEMOSPHERE  202205
影響因子：IF 8.8
技術(shù)平臺(tái)：原核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析、WGCNA分析
實(shí)驗(yàn)樣本：微藻
 
研究背景：
由于鎘(Cd)的生物蓄積性和生物不可降解性，即使在低濃度下，鎘也會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。微藻是一種很有前途的重金屬去除劑和有效的工業(yè)污水凈化劑。然而，關(guān)于鎘脅迫下微藻的短期和長(zhǎng)期響應(yīng)分子機(jī)制的詳細(xì)報(bào)道很少。本研究對(duì)微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行為（生長(zhǎng)曲線、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)動(dòng)態(tài)變化）、細(xì)胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和脅迫響應(yīng)機(jī)制進(jìn)行探討。
 
研究結(jié)果：
本研究通過原核生物的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq在對(duì)照和15 min、48 h、72 h和96 h處理組中檢測(cè)到1413個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）。這些基因被證明是鎘敏感DEGs，且與核糖體、氮代謝、硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和光合作用相關(guān)。WGCNA（加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析）揭示了兩種主要的基因表達(dá)模式：短期響應(yīng)（381個(gè)基因）和長(zhǎng)期響應(yīng)（364個(gè)基因）。DEGs富集分析表明，參與氮（N）代謝、硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表達(dá)顯著上調(diào)，為初期合成金屬螯合蛋白、抗性金屬蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）的重要組分（半胱氨酸）提供了原料，是一種短期響應(yīng)機(jī)制。前15分鐘的Cd吸附主要依賴于膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和預(yù)先蓄積的EPS。同時(shí)，上調(diào)的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）家族蛋白在外源性鎘的初始抗性中發(fā)揮作用。受損的光合系統(tǒng)在后期得到修復(fù)，糖酵解和糖異生表達(dá)上調(diào)，滿足生理代謝活動(dòng)的能量和物質(zhì)。本研究首次提供了微藻響應(yīng)鎘脅迫的短期和長(zhǎng)期分子機(jī)制。同時(shí)，本研究中鑒定的關(guān)鍵基因可以作為藻類基因工程的潛在靶點(diǎn)。


參考文獻(xiàn)：
Knödlseder N, et al. Engineering selectivity of Cutibacterium acnes phages by epigenetic imprinting. PLoS Pathog. 2022 Mar;18(3):e1010420.
Tian Q, et al. Longitudinal physiological and transcriptomic analyses reveal the short term and long term response of Synechocystis sp. PCC6803 to cadmium stress. Chemosphere. 2022 Sep;303(Pt 1):134727.