ChIP-seq揭示BRWD3調(diào)控KDM5活性以維持H3K4甲基化水平的表觀機(jī)制應(yīng)用
組蛋白修飾對(duì)調(diào)控染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)至關(guān)重要，組蛋白修飾失調(diào)可能導(dǎo)致疾病狀態(tài)和癌癥。染色質(zhì)結(jié)合蛋白BRWD3（Bromodomain and WD repeat-containing protein 3）是Cul4-DDB1 E3泛素連接酶復(fù)合體的已知底物特異性因子，敲除BRWD3會(huì)導(dǎo)致H3K4me1（H3 lysine 4 monomethylation）水平增加。然而，連接BRWD3和H3K4甲基化的潛在機(jī)制尚不明確。
2023年9月26日，美國范德比爾特大學(xué)生物科學(xué)系Jared T. Nordman團(tuán)隊(duì)在美國國家科學(xué)院院刊（PNAS）上發(fā)表題為“BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels”的研究論文。該研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等分析揭示了BRWD3促進(jìn)組蛋白去甲基化酶 5(lysine-specific demethylases 5,KDM5)降解以維持H3K4甲基化水平。
期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences
影響因子：IF 11.1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等
研究摘要：
本研究結(jié)果顯示BRWD3敲除不僅會(huì)導(dǎo)致H3K4me1水平增加，還會(huì)導(dǎo)致H3K4me 水平降低，表明BRWD3對(duì)H3K4甲基化的影響具有廣泛性。通過免疫沉淀結(jié)合定量質(zhì)譜分析鑒定出BRWD3與H3K4特異性組蛋白去甲基化酶5（KDM5/Lid）之間的相互作用，KDM5是一種從H3K4中去除三甲基和二甲基標(biāo)記的酶。此外染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)數(shù)據(jù)分析顯示，BRWD3和KDM5在全基因組中顯著共定位，且H3K4me3在BRWD3結(jié)合位點(diǎn)高度富集。BRWD3促進(jìn)K48連接多泛素化和KDM5降解，并且KDM5降解依賴于BRWD3和Cul4。而敲除KDM5完全恢復(fù)改變的H3K4me3水平，部分恢復(fù)BRWD3敲除后的H3K4me1水平�？傊狙芯拷Y(jié)果表明，BRWD3調(diào)節(jié)KDM5活性以維持H3K4甲基化水平。
研究方法：
研究結(jié)果：
（1）BRWD3影響H3K4單甲基化、二甲基化和三甲基化水平
圖1：BRWD3影響H3K4甲基化水平。
A-B. 果蠅S2細(xì)胞中H3K4me1（A）和H3K4me3（B）歸一化強(qiáng)度（Normalized Intensity）的IF定量分析。每個(gè)點(diǎn)表示每個(gè)細(xì)胞核的H3K4甲基化強(qiáng)度與總DNA含量的歸一化。每個(gè)分布表示從三個(gè)生物學(xué)重復(fù)中隨機(jī)選擇的1000個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度。使用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)，P＜0.0001。
C. 無dsRNA對(duì)照組（WT）和兩種dsRNA敲除BRWD3的S2細(xì)胞中產(chǎn)生的g歸一化ChIP-seq圖譜中的代表性H3K4me3 peaks。
D. peaks歸一化H3K4me3-ChIP-seq信號(hào)的富集熱圖，通過所有公布的H3K4me3 peaks中心周圍的平均占有率排序。
E. H3標(biāo)記在BRWD3結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的富集。顯示了每個(gè)標(biāo)記peaks集的重疊相對(duì)于預(yù)期重疊的Log2富集。
F. BRWD3和H3K4me3-ChIP-seq基因軌跡相似性的代表性視圖。
（2）BRWD3與H3K4me3組蛋白去甲基化酶KDM5/Lidex的結(jié)合
圖2：BRWD3和KDM5w位于相同復(fù)合體中，結(jié)合相同的基因組區(qū)域
（3）BRWD3促進(jìn)KDM5泛素化和降解
（4）抑制KDM5可以恢復(fù)在BRWD3敲除后改變的H3K4me3水平
圖4：抑制KDM5可以恢復(fù)BRWD3敲除后改變的H3K4甲基化水平
A-B. 使用抗H3K4me3抗體（A）或抗H3K4me1抗體（B）在果蠅S2細(xì)胞中進(jìn)行定量IF檢測的小提琴圖。在共敲除中使用了5微克的KDM5 dsRNA。每個(gè)分布表示從三個(gè)生物學(xué)重復(fù)中隨機(jī)選擇的1000個(gè)細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度，使用單因素方差分析和Tukey多重比較檢驗(yàn)，****P＜0.0001。
C. BRWD3單個(gè)拷貝的缺失導(dǎo)致了依賴于KDM5的Su（var）表型。
D. BRWD3依賴性調(diào)控H3K4甲基化水平模型。BRWD3靶向KDM5降解。在BRWD3缺失情況下，KDM5活性增加，導(dǎo)致H3K4me3去甲基化，從而促進(jìn)H3K4me1水平升高。
研究意義：
H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，但調(diào)控H3K4me3水平的機(jī)制尚不清楚。本研究分析了BRWD在調(diào)控H3K4甲基化中的作用，BRWD3是一種染色質(zhì)結(jié)合蛋白和Cul4DDB1泛素連接酶復(fù)合體的底物特異性因子。分析結(jié)果顯示BRWD3敲除不僅會(huì)增加H3K4me1水平，而且還會(huì)降低H3K4me3水平。BRWD3與KDM5/Lide（KDM5/Lid是一種主要去除H3K4三甲基和二甲基標(biāo)記的去甲基化酶）的結(jié)合，BRWD3可以通過K48連接多泛素化促進(jìn)KDM5降解，KDM5共敲除可恢復(fù)與BRWD3缺失相關(guān)的H3K4me3水平。本研究結(jié)果表明BRWD3是調(diào)控H3K4甲基化水平維持的關(guān)鍵因子。
參考文獻(xiàn)：
Han D, Schaffner SH, Davies JP, Benton ML, Plate L, Nordman JT. BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Sep 26;120(39):e2305092120.
2023年9月26日，美國范德比爾特大學(xué)生物科學(xué)系Jared T. Nordman團(tuán)隊(duì)在美國國家科學(xué)院院刊（PNAS）上發(fā)表題為“BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels”的研究論文。該研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀測序（ChIP-seq）等分析揭示了BRWD3促進(jìn)組蛋白去甲基化酶 5(lysine-specific demethylases 5,KDM5)降解以維持H3K4甲基化水平。
標(biāo)題：BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels（BRWD3促進(jìn)KDM5降解以維持H3K4甲基化水平）
時(shí)間：2023-09-26期刊：Proceedings of the National Academy of Sciences
影響因子：IF 11.1
技術(shù)平臺(tái)：ChIP-seq、ChIP-qPCR、RNA-seq等
研究摘要：
本研究結(jié)果顯示BRWD3敲除不僅會(huì)導(dǎo)致H3K4me1水平增加，還會(huì)導(dǎo)致H3K4me 水平降低，表明BRWD3對(duì)H3K4甲基化的影響具有廣泛性。通過免疫沉淀結(jié)合定量質(zhì)譜分析鑒定出BRWD3與H3K4特異性組蛋白去甲基化酶5（KDM5/Lid）之間的相互作用，KDM5是一種從H3K4中去除三甲基和二甲基標(biāo)記的酶。此外染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-seq)數(shù)據(jù)分析顯示，BRWD3和KDM5在全基因組中顯著共定位，且H3K4me3在BRWD3結(jié)合位點(diǎn)高度富集。BRWD3促進(jìn)K48連接多泛素化和KDM5降解，并且KDM5降解依賴于BRWD3和Cul4。而敲除KDM5完全恢復(fù)改變的H3K4me3水平，部分恢復(fù)BRWD3敲除后的H3K4me1水平�？傊狙芯拷Y(jié)果表明，BRWD3調(diào)節(jié)KDM5活性以維持H3K4甲基化水平。
研究方法：
（1）BRWD3影響H3K4單甲基化、二甲基化和三甲基化水平
圖1：BRWD3影響H3K4甲基化水平。
C. 無dsRNA對(duì)照組（WT）和兩種dsRNA敲除BRWD3的S2細(xì)胞中產(chǎn)生的g歸一化ChIP-seq圖譜中的代表性H3K4me3 peaks。
D. peaks歸一化H3K4me3-ChIP-seq信號(hào)的富集熱圖，通過所有公布的H3K4me3 peaks中心周圍的平均占有率排序。
E. H3標(biāo)記在BRWD3結(jié)合位點(diǎn)內(nèi)的富集。顯示了每個(gè)標(biāo)記peaks集的重疊相對(duì)于預(yù)期重疊的Log2富集。
F. BRWD3和H3K4me3-ChIP-seq基因軌跡相似性的代表性視圖。
（2）BRWD3與H3K4me3組蛋白去甲基化酶KDM5/Lidex的結(jié)合
圖2：BRWD3和KDM5w位于相同復(fù)合體中，結(jié)合相同的基因組區(qū)域
- 果蠅胚胎的BRWD3-HA IP的質(zhì)譜分析流程。
- BRWD3-IP-TMT-MS火山圖結(jié)果。藍(lán)點(diǎn)表示與陰性對(duì)照相比BRWD3-HA-IP顯著富。紅點(diǎn)表示Cul4-DDB1-BRWD3 E3泛素連接酶復(fù)合體。
- BRWD3和KDM5 ChIP-seq軌跡相似性的代表性視圖（左）。Venn圖量化基因組上BRWD3和KDM5結(jié)合位點(diǎn)之間的重疊，P＜0.0001（右）。
（3）BRWD3促進(jìn)KDM5泛素化和降解
圖3：BRWD3促進(jìn)KDM5的泛素化和降解。
- 在BRWD3-V5共轉(zhuǎn)染（OE）、野生型（WT）或BRWD3-RNAi（KD）條件下，HA標(biāo)記的KDM5和/或FLAG標(biāo)記的泛素共轉(zhuǎn)染的果蠅S2細(xì)胞的Denaturing IP分析。
- Denaturing IP的免疫沉淀用K48-或K63-連接的多泛素鏈特異性抗體與抗HA抗體進(jìn)行聯(lián)合印跡分析。
- 用表達(dá)KDM5-HA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞，并用環(huán)己酰亞胺（CHX）單獨(dú)或與蛋白酶體抑制劑MG-132聯(lián)合處理。經(jīng)CHX處理指定時(shí)間后，用抗HA抗體進(jìn)行western blots檢測KDM5-HA水平。
- 與C類似，但分別使用BRWD3 RNAi或GFPi RNAi處理。
- 在指定時(shí)間點(diǎn)對(duì)（D）的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行KDM5-HA水平定量，歸一化為總負(fù)載蛋白水平。
- 與C類似，用GFPi-RNAi、Cul4-RNAi或Cullin抑制劑（MLN4924）處理S2細(xì)胞。
- 在指定時(shí)間點(diǎn)對(duì)來自F的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的剩余KDM5-HA水平進(jìn)行定量分析。
（4）抑制KDM5可以恢復(fù)在BRWD3敲除后改變的H3K4me3水平
圖4：抑制KDM5可以恢復(fù)BRWD3敲除后改變的H3K4甲基化水平
C. BRWD3單個(gè)拷貝的缺失導(dǎo)致了依賴于KDM5的Su（var）表型。
D. BRWD3依賴性調(diào)控H3K4甲基化水平模型。BRWD3靶向KDM5降解。在BRWD3缺失情況下，KDM5活性增加，導(dǎo)致H3K4me3去甲基化，從而促進(jìn)H3K4me1水平升高。
研究意義：
H3K4甲基化與基因轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)，但調(diào)控H3K4me3水平的機(jī)制尚不清楚。本研究分析了BRWD在調(diào)控H3K4甲基化中的作用，BRWD3是一種染色質(zhì)結(jié)合蛋白和Cul4DDB1泛素連接酶復(fù)合體的底物特異性因子。分析結(jié)果顯示BRWD3敲除不僅會(huì)增加H3K4me1水平，而且還會(huì)降低H3K4me3水平。BRWD3與KDM5/Lide（KDM5/Lid是一種主要去除H3K4三甲基和二甲基標(biāo)記的去甲基化酶）的結(jié)合，BRWD3可以通過K48連接多泛素化促進(jìn)KDM5降解，KDM5共敲除可恢復(fù)與BRWD3缺失相關(guān)的H3K4me3水平。本研究結(jié)果表明BRWD3是調(diào)控H3K4甲基化水平維持的關(guān)鍵因子。
參考文獻(xiàn)：
Han D, Schaffner SH, Davies JP, Benton ML, Plate L, Nordman JT. BRWD3 promotes KDM5 degradation to maintain H3K4 methylation levels. Proc Natl Acad Sci U S A. 2023 Sep 26;120(39):e2305092120.
標(biāo)簽：
ChIP-seq
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