cfDNA甲基化診斷和監(jiān)測(cè)腫瘤的研究進(jìn)展與展望之胰腺癌
胰腺癌因其病死率高而成為目前最具挑戰(zhàn)性的惡性腫瘤之一。考慮到目前的治療方案診斷較晚，生存獲益有限，優(yōu)化早期檢測(cè)、預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)勢(shì)在必行。近年來(lái)大量研究以開發(fā)基于液體活檢的胰腺癌生物標(biāo)志物。越來(lái)越多研究指出，細(xì)胞游離DNA (cfDNA)甲基化分析是一種有前景的非侵入性方法，可用于發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證具有診斷或預(yù)后潛力的表觀遺傳生物標(biāo)志物。本文就胰腺癌中cfDNA甲基化的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，討論了DNA甲基化在胰腺癌中的相關(guān)性、近期cfDNA甲基化研究及其臨床應(yīng)用，以及將cfDNA甲基化分析應(yīng)用于常規(guī)臨床實(shí)踐的未來(lái)方向。
背景介紹（Introduction）
胰腺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家死亡率第三高的腫瘤，也是3年生存率最低的腫瘤（5%）。胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常見的胰腺癌類型，占所有病例的80%以上。目前碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是胰腺癌臨床診斷中唯一常規(guī)使用的血液生物標(biāo)志物，其靈敏度（79%）和特異性（82%）相對(duì)較低。轉(zhuǎn)移性PDAC患者的CA19-9水平與生存率之間存在關(guān)系。 在臨床實(shí)踐中，對(duì)于疾病過程中CA19-9水平變化的解釋尚未達(dá)成共識(shí)。
因此，開發(fā)基于血液的胰腺癌替代生物標(biāo)志物勢(shì)在必行，這些生物標(biāo)志物有助于早期診斷、精準(zhǔn)分層、選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨�、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、評(píng)估治療耐藥性、鑒定微小殘留病灶和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。液體活檢是對(duì)循環(huán)血液成分中的分子生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，已成為克服癌癥診斷和監(jiān)測(cè)挑戰(zhàn)的一種有前景方法(圖1)。通過檢測(cè)和分析血液中循環(huán)游離DNA（cfDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和其他生物標(biāo)志物的基因突變，液體活檢為評(píng)估腫瘤特征和監(jiān)測(cè)治療應(yīng)答提供了一種非侵入性方法。
圖1：血液液體活檢在胰腺癌診斷和治療中的應(yīng)用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)和循環(huán)游離DNA (cfDNA)是液體活檢的重要生物標(biāo)志物，可提供非侵入性診斷、預(yù)后和治療信息。特別是cfDNA分析可以揭示引發(fā)腫瘤的遺傳學(xué)變化，如基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、雜合性缺失(LOH)或異常甲基化模式。在胰腺癌患者的cfDNA中最常檢測(cè)到的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4和FBXW7。在胰腺癌中，與甲基化相關(guān)的循環(huán)生物標(biāo)志物有BNC1、NPTX2、SFRP1、RASSF1A和TFPI2。
在癌細(xì)胞中經(jīng)常觀察到異常的DNA甲基化模式變化，這些變化可反映在血液循環(huán)中的cfDNA中。檢測(cè)血流中的這些甲基化變化有望用于早期癌癥檢測(cè)，并有可能通過及時(shí)干預(yù)改善結(jié)局。本文首先對(duì)cfDNA在胰腺癌中的研究進(jìn)行回顧；然后分析了DNA甲基化在胰腺癌背景下的相關(guān)性，總結(jié)cfDNA甲基化的最新研究，特別強(qiáng)調(diào)其臨床效用；最后討論了cfDNA甲基化分析的未來(lái)方向、臨床轉(zhuǎn)化以及將其應(yīng)用到常規(guī)臨床實(shí)踐中的可能性。
循環(huán)cfDNA作為胰腺癌的血液生物標(biāo)志物
那些存在于血液中的DNA片段被稱為循環(huán)游離DNA (cfDNA)，cfDNA可來(lái)源于正常細(xì)胞更新、凋亡或壞死細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。在cfDNA中可以檢測(cè)到腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，包括基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、雜合性丟失(LOH)和異常甲基化模式。cfDNA大小為40~200個(gè)堿基對(duì)(bp)，peak值約為166bp，健康個(gè)體中cfDNA片段長(zhǎng)度中位數(shù)比癌癥患者大。
與腫瘤組織活檢相比，cfDNA不僅更好地描述了腫瘤的完整情況，而且提供了重復(fù)采樣和分析的可能性，從而可以縱向評(píng)估cfDNA濃度的動(dòng)態(tài)變化、鑒定獲得性耐藥突變和監(jiān)測(cè)克隆進(jìn)化。然而將cfDNA作為癌癥的血液生物標(biāo)志物進(jìn)行分析也有一些局限性。cfDNA診斷和預(yù)后效用的一個(gè)重要方面是其血漿低濃度，這使檢測(cè)和分析更為復(fù)雜化。據(jù)估計(jì)，每毫升血漿中約有10-15 ng cfDNA，在大多數(shù)早期癌癥中，循環(huán)腫瘤DNA只占cfDNA的一小部分。這些考慮突出了對(duì)超靈敏檢測(cè)方法的要求。最靈敏的方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，如BEAMing單分子PCR、TAm-Seq、數(shù)字PCR和微滴數(shù)字PCR。胰腺癌的cfDNA作為一種有前景的早期檢測(cè)和預(yù)后生物標(biāo)志物受到越來(lái)越多關(guān)注。最近的研究表明，80%以上的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者中檢測(cè)到循環(huán)cfDNA的遺傳學(xué)變化，但僅在48%的局限性腫瘤患者中檢測(cè)到。
胰腺癌在雜合性缺失(LOH)情況下，對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)進(jìn)行的液體活檢研究非常罕見或不存在。Chakrabarti等評(píng)估了使用Guardant360技術(shù)分析了循環(huán)腫瘤DNA中的MSI狀態(tài)可否預(yù)測(cè)PDAC患者對(duì)免疫治療的穩(wěn)健應(yīng)答。結(jié)果表明在83%的患者的組織MSI結(jié)果與血漿G360結(jié)果一致。此外，在1例患者的腫瘤組織中未檢測(cè)到MSI，而血漿中檢測(cè)到MSI。
胰腺癌中最常見的血液生物標(biāo)志物研究包括對(duì)cfDNA循環(huán)突變分析，最常見的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4或FBXW7。這些突變與腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變同時(shí)發(fā)生，強(qiáng)調(diào)了cfDNA作為有價(jià)值的胰腺癌血液生物標(biāo)志物的潛力。一些研究已經(jīng)證實(shí)了在循環(huán)cfDNA中檢測(cè)到KRAS突變與局部晚期或轉(zhuǎn)移性PDAC患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，一些研究還將檢測(cè)循環(huán)cfDNA中的KRAS突變作為生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和鑒定胰腺癌耐藥的早期跡象。在最近的一項(xiàng)研究中，不可切除胰腺癌患者的cfDNA中存在KRAS突變與不良治療結(jié)果強(qiáng)相關(guān)，并提示這一分子評(píng)估可作為評(píng)估早期腫瘤進(jìn)展的生物標(biāo)志物。
目前的研究強(qiáng)調(diào)了cfDNA作為預(yù)測(cè)PDAC患者預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)志物來(lái)源潛力。在整個(gè)治療過程中，cfDNA基因圖譜變化可作為治療應(yīng)答或耐藥的早期指標(biāo)，從而為利用生物標(biāo)志物進(jìn)展來(lái)指導(dǎo)治療決策提供了一個(gè)有前景的途徑。
盡管如此，仍然迫切需要推進(jìn)更靈敏技術(shù)的開發(fā)，這些技術(shù)能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤來(lái)源的循環(huán)DNA檢測(cè)，并提高預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。超靈敏技術(shù)結(jié)合和表觀遺傳標(biāo)記(如cfDNA甲基化)的整合為提高胰腺癌cfDNA分析的靈敏度和特異性提供了一個(gè)有希望的機(jī)會(huì)(圖1)。
DNA甲基化與胰腺癌
近年來(lái)，試圖鑒定胰腺癌中甲基化標(biāo)志物的研究越來(lái)越多。DNA甲基化可逆，從治療角度來(lái)看具有很高的研究?jī)r(jià)值。DNA甲基化在CpG二核苷酸胞嘧啶C5位點(diǎn)上添加或移除一個(gè)甲基(CH3)，CpG二核苷酸主要存在于CpG島的特定基因組區(qū)域中。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化模式構(gòu)建主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 (DNMT3)家族介導(dǎo)，包括DNMT3A和DNMT3B。一旦構(gòu)建，這些模式隨后通過DNMT1作用來(lái)維持。在正常細(xì)胞中，正確DNA甲基化模式保證了基因表達(dá)的正確和精確調(diào)控，并維持穩(wěn)定的基因沉默。因異常甲基化模式被廣泛認(rèn)為是許多類型癌癥的表觀遺傳標(biāo)志，通常在癌癥中觀察到低甲基化和高甲基化事件。具體來(lái)說(shuō)，在基因缺失區(qū)域和重復(fù)序列中，甲基化CpG含量整體下降；從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，激活先前沉默的致癌基因。癌癥常表現(xiàn)為基因啟動(dòng)子的局部高甲基化，導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默。
目前對(duì)胰腺組織活檢、細(xì)胞系或異種移植模型的大量研究來(lái)解讀胰腺疾病的特異性甲基化模式，以作為胰腺腫瘤的診斷或預(yù)后工具。在胰腺癌中，近80%的病例顯示DNMT1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致高甲基化。高甲基化被認(rèn)為是胰腺癌中最主要的異常表觀遺傳學(xué)改變。這種異常高甲基化的影響主要在腫瘤抑制基因中觀察到。CDKN2A/p16INK4是胰腺癌中第一個(gè)因啟動(dòng)子異常高甲基化而失活的抑癌基因，它在抑制細(xì)胞周期由G1期向S期進(jìn)展，確保細(xì)胞周期停滯中起著至關(guān)重要的作用。在胰腺外分泌和上皮內(nèi)腫瘤新鮮冷凍組織、人胰腺癌細(xì)胞系和異種移植物中進(jìn)行的其他研究表明，在胰腺癌中，細(xì)胞通過G1期進(jìn)展的其他負(fù)調(diào)控因子，如細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑CDKN1C/p51KIP2和細(xì)胞周期蛋白CCND2的高甲基化和隨后的下調(diào)。在胰腺腫瘤中，由于異常高甲基化而導(dǎo)致表達(dá)降低的其他腫瘤抑制基因包括前腦腦肽原(PENK，在分析的93.3%的腫瘤樣本中高甲基化)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制基因1 (SOCS-1, 57.1%)、原鈣黏蛋白10 (PCDH10, 60.9%)、iroquois同源盒4 (IRX4, 64%)和reprimo (RPRM, 57%)等。
胰腺癌中除抑癌基因異常高甲基化外，某些基因也存在異常低甲基化。這種低甲基化主要發(fā)生在特定基因的啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致其過表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。其中一個(gè)基因是絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINB5 (Maspin)。據(jù)報(bào)道SERPINB5基因在87%的胰腺癌細(xì)胞系(20/23)、94%的異種移植物(32/34)中完全未甲基化，在86%的原發(fā)性胰腺癌(6/7)中低甲基化，該基因甲基化與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在臨床樣本中，未甲基化SERPINB5的存在已經(jīng)證明了其作為胰腺腫瘤特異性生物標(biāo)志物的潛力，使胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)與胰腺炎的鑒別成為可能。通過將甲基化和表達(dá)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合的多組學(xué)分析，有令人振奮的證據(jù)表明，在胰腺癌組織中，與低甲基化狀態(tài)相關(guān)的特定基因上調(diào)，包括磺基轉(zhuǎn)移酶家族1E成員1 (SULT1E1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3 (IGF2BP3)和絲裂原活化蛋白4激酶4 (MAP4K4)。這些基因的甲基化和表達(dá)譜變化與胰腺癌患者的總生存期顯著相關(guān)，因此提示它們作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在效用。另外幾個(gè)基因在胰腺癌組織中因異常低甲基化而過表達(dá)，包括MUC4、CLDN4、LCN2、SFN、TFF2、S100A4、MSLN和PSCA。
此外，近年來(lái)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)作為一種生物學(xué)功能尚不明確的氧化形式的5mC，作為癌癥診斷和生存的潛在生物標(biāo)志物引起了極大的興趣。一些研究報(bào)道，5hmC水平在人類癌癥中顯著降低，胰腺癌被描述為導(dǎo)致游離細(xì)胞羥甲基化的疾病特異性變化。
綜上所述，表觀遺傳改變?cè)谝认侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。因此，對(duì)胰腺癌發(fā)生的異常表觀遺傳修飾進(jìn)行綜合分析，對(duì)胰腺癌的分子診斷和治療監(jiān)測(cè)具有重要意義。
胰腺癌cfDNA甲基化研究分析
對(duì)胰腺癌血漿中甲基化生物標(biāo)志物的探索仍處于早期階段，迄今為此開展的研究數(shù)量有限。胰腺癌的cfDNA甲基化模式分析已在全基因組水平以及通過鑒定和描述單個(gè)基因或小基因panel來(lái)進(jìn)行。關(guān)于全基因組測(cè)序方法，已經(jīng)發(fā)表了多項(xiàng)研究。本文主要探究單個(gè)基因或小基因panel作為未來(lái)臨床應(yīng)用的潛在生物標(biāo)志物的效用 (表1)。首項(xiàng)關(guān)于鑒定血漿中胰腺癌甲基化標(biāo)志物的研究始于2007年。Jiao等通過甲基化特異性PCR (MSP)檢測(cè)了83例未經(jīng)治療的胰腺癌患者血漿樣本中ppENK和p16基因的甲基化狀態(tài)。ppENK和p16啟動(dòng)子甲基化率分別為29.3%和24.6%。在83例患者中，9例成對(duì)的胰腺腫瘤組織切片在相同甲基化的腫瘤患者血漿樣本中，p16和ppENK基因的高甲基化率分別為60%和80%。作者得出結(jié)論，血漿DNA在檢測(cè)胰腺癌表觀遺傳學(xué)變化中可能具有替代腫瘤組織的價(jià)值。然而對(duì)于潛在診斷標(biāo)志物而言，所獲得的靈敏度太低，這可能是由于分析的成對(duì)血漿/腫瘤樣本數(shù)量少。此外，本研究缺乏健康人和良性胰腺疾病患者組成的對(duì)照組數(shù)據(jù)。
表1：血漿/血清中游離DNA甲基化作為胰腺癌診斷和/或預(yù)后生物標(biāo)志物的研究
此后不久，另一項(xiàng)開創(chuàng)性研究發(fā)表，表明可以通過使用血漿中循環(huán)cfDNA的甲基化譜來(lái)檢測(cè)胰腺癌。Melnikov等分析了30例PDAC患者和30例年齡匹配的健康志愿者的甲基化特征。當(dāng)時(shí)引入了一種名為MethDet56的新技術(shù)，該研究使用了包含56個(gè)頻繁甲基化基因的芯片檢測(cè)panel。這一創(chuàng)新方法旨在通過甲基化靈敏的核酸內(nèi)切酶消化標(biāo)靶序列，然后使用PCR擴(kuò)增未消化的片段，從而檢測(cè)標(biāo)靶序列的甲基化水平。CCND2、PLAU、SOCS1、THBS和VHL等5個(gè)基因在PDAC患者血漿中的甲基化水平低于健康對(duì)照組，低甲基化模式的靈敏度為76%，特異性為59%。作者將這組基因歸類為復(fù)合生物標(biāo)志物，從而確立了其對(duì)采用基于血漿的方法檢測(cè)胰腺癌的一致預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，他們認(rèn)為啟動(dòng)子的非甲基化狀態(tài)在腫瘤檢測(cè)方面更有價(jià)值。然而這些發(fā)現(xiàn)尚未得到后續(xù)研究驗(yàn)證，并且將血漿cfDNA中的低甲基化特定基因用作PDAC的生物標(biāo)志物仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。
同一研究小組使用他們開發(fā)的MethDet56方法，比較30例PDAC患者、30例慢性胰腺炎患者和30例健康對(duì)照者血漿cfDNA甲基化，每組年齡、性別和種族分布相似。為了確定血漿中的特異性甲基化譜，研究者選擇了8個(gè)含信息基因（informative genes ）(BRCA1、CCND2、CDKN1C、MLH1、近端和遠(yuǎn)端PGR啟動(dòng)子區(qū)、SYK和VHL)的啟動(dòng)子，以區(qū)分慢性胰腺炎和健康對(duì)照(靈敏度為78%，特異性為81.7%)。當(dāng)比較慢性胰腺炎和PDAC時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因啟動(dòng)子(CCND2、CDKN1C、CDKN2B、DAPK1、ESR1啟動(dòng)子A、MGMT、MLH1、MUC2、MYOD1、PGK1、PGR啟動(dòng)子近端區(qū)域、RARB、RB1和SYK)存在差異甲基化(90.8%靈敏度和91.2%特異性)。14個(gè)基因啟動(dòng)子中有9個(gè)為慢性胰腺炎特異性啟動(dòng)子，5個(gè)為兩組共有。在這組共有的5個(gè)基因中觀察到在慢性胰腺炎中高甲基化的基因在PDAC中低甲基化。
幾年后，MethDet56方法被用于研究PDAC和結(jié)直腸癌(CRC)是否在血漿cfDNA中的共有甲基化標(biāo)志物。7個(gè)基因panel(MDR1、SRBC、VHL、MUC2、RB1、SYK和GPC3)被鑒定為區(qū)分CRC或PDAC與健康對(duì)照的最佳循環(huán)甲基化標(biāo)簽。此外，一項(xiàng)該panel進(jìn)行的限制性更強(qiáng)的分析結(jié)果表明，GPC3是有效區(qū)分PDAC和健康對(duì)照的唯一基因，而VHL和SRBC是PDAC和CRC的信息基因。
Park J.W.等在2012年發(fā)表了兩項(xiàng)研究，使用MSP技術(shù)在血漿中診斷胰腺癌。第一項(xiàng)是初步研究(16例胰腺癌患者，13例慢性胰腺炎患者和29例健康對(duì)照)，該研究使用了6個(gè)候選基因，這些候選基因基于Sato等人2003年在原發(fā)性胰腺癌和正常胰腺導(dǎo)管上皮中獲得的結(jié)果選擇。UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A基因啟動(dòng)子在PDAC患者和健康對(duì)照之間存在差異甲基化，但p16基因啟動(dòng)子在PDAC患者和慢性胰腺炎患者之間存在差異甲基化。慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危險(xiǎn)因素，繼這些結(jié)果和之前從胰腺癌細(xì)胞學(xué)樣本中獲得結(jié)果之后，作者重點(diǎn)研究了一個(gè)更大的血漿隊(duì)列中NPTX2的甲基化狀態(tài)，該隊(duì)列包括104例PDAC患者、60例慢性胰腺炎患者和5例良性膽道結(jié)石患者。NPTX2甲基化在PDAC組中顯著升高(84%的PDAC患者，慢性胰腺炎和良性膽石病組分別為33%和0%;P = 0.016)，其靈敏度和特異性分別為80%和76%，且與腫瘤分期的惡化呈正相關(guān)。
Singh及其合作者于2020年分析了Park等2012年檢測(cè)的6種生物標(biāo)志物中的3種(UCHL1、PENK和NPTX2基因啟動(dòng)子)，并將SPARC基因加入研究。從61例PDAC患者、22例慢性胰腺炎患者和21名健康受試者的cfDNA中通過定量MSP (qMSP)獲得的絕對(duì)拷貝數(shù)計(jì)算基因甲基化指數(shù)(MI)。這4個(gè)基因在PDAC中的MI顯著高于健康對(duì)照組，SPARC MI能夠鑒別早期PDAC和慢性胰腺炎。此外，較高的UCHL1 MI與疾病的晚期相關(guān)；SPARC和NPTX2基因的高M(jìn)I與PDAC的低生存率相關(guān)。
2013年，Kawasaki等利用MSP技術(shù)研究了不同類型癌癥患者（包括47名PDAC患者）cfDNA中細(xì)胞周期相關(guān)基因(APC、DCC、p16、p14、RASSF1A)的甲基化率。RASSF1A和APC的甲基化率最高，分別為34和23.4%，其次為p16和p14。然而本研究缺乏健康對(duì)照組，且RASSF1A甲基化百分比在其他類型的癌癥如肝細(xì)胞癌中相似甚至更高。
同樣在2013年，Yi等通過轉(zhuǎn)錄組微陣列對(duì)4種胰腺癌細(xì)胞系中獲得的1427個(gè)特異性基因進(jìn)行癌癥特異性甲基化過濾后，通過MSP分析了8個(gè)候選基因的甲基化狀態(tài)。bbnc1和ADAMTS1啟動(dòng)子基因在原發(fā)性PDAC腫瘤樣本中表現(xiàn)出最高的甲基化率(分別為91%和67%;n=123)和癌前胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)樣本(分別為70%和25%;n=20)。然后使用甲基化磁珠(Methylation On Beads, MOB)方法在血清樣本(42例PDAC患者和26名健康個(gè)體)中驗(yàn)證這些生物標(biāo)志物，這是一種捕獲、保留和亞硫酸鹽處理微量DNA的納米技術(shù)。在I期PDAC樣本中，BNC1的靈敏度達(dá)到79%，ADAMTS1的靈敏度達(dá)到48%，這兩個(gè)基因的靈敏度均提高至90%。BNC1和ADAMTS1的特異度分別為89%和92%。結(jié)合這兩種基因，檢測(cè)極早期胰腺癌的靈敏度提高(81%)，但特異性未提高(85%)。
9年后，同一組研究人員通過qMSP方法在39例PDAC患者、95例匹配的年齡對(duì)照和8例慢性胰腺炎患者組成的獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了這組有前景的生物標(biāo)志物。在87.2%和65.1%的PDAC病例中檢測(cè)到ADAMTS1和BNC1甲基化，而在非癌癥患者中分別檢測(cè)到4.2%和6.3%。兩基因組合(ADAMTS1和/或BNC1)改善了個(gè)體結(jié)果，在患者和對(duì)照中分別達(dá)到97.4%和8.4%的甲基化水平。該組合也在87.5%慢性胰腺炎樣本中顯示了甲基化，未能區(qū)分PDAC和慢性胰腺炎。在I期、IIA期、IIB期、III期和IV期胰腺癌患者中，ADAMTS1 / BNC1組合的cfDNA甲基化率分別為100%、88.9%、100%，將CA19-9納入分析后，未見明顯改善。根據(jù)這些結(jié)果，作者強(qiáng)調(diào)ADAMTS1和BNC1是在疾病初期階段cfDNA中早期檢測(cè)胰腺癌的可靠標(biāo)志物，這為治愈性腫瘤切除術(shù)提供了治療機(jī)會(huì)。
2021年，為了提高診斷潛力，同一研究組將LRFN5和PXDN基因加入到ADAMTS1/BNC1聯(lián)合甲基化panel中。采用MSP法檢測(cè)106例FFPE組織樣本(44例PDAC (I-IV期)、15例PanIN、24例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤、15例慢性胰腺炎和8例非癌對(duì)照) 中的甲基化水平，并使用MOB和qMSP檢測(cè)32例血漿(22例PDAC (I-IV期)和10例健康對(duì)照)中甲基化水平。
將LRFN5/PXDN添加到生物標(biāo)志物組中提高了癌前和早期癌癥檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確性，AUC為0.94。此外，在血漿中獲得的4個(gè)基因組的靈敏度和特異度分別為100%和90%。本研究納入的人群具有多樣性，增強(qiáng)了研究結(jié)果的廣泛適用性。血漿樣本量明顯小于腫瘤組織樣本量。作者認(rèn)為，cfDNA中4基因組的甲基化頻率與組織中相當(dāng)，盡管較低，可能是由于存在腫瘤異質(zhì)性，這表明這些生物標(biāo)志物基因?qū)δ軌蜓袛U(kuò)散的腫瘤克隆至關(guān)重要。
Henriksen團(tuán)隊(duì)采用了一種獨(dú)特的方法，專注于開發(fā)基于cfDNA甲基化的預(yù)測(cè)模型，用于胰腺癌診斷、生存預(yù)測(cè)和預(yù)后。2016年，Henriksen等人利用優(yōu)化亞硫酸鹽處理方案和兩輪MSP和qMSP(外部和內(nèi)部甲基化特異性引物和探針)評(píng)估了基于之前文獻(xiàn)的發(fā)現(xiàn)選擇的28個(gè)基因panel。共納入95例PDAC患者，其中慢性胰腺炎組97例，急性胰腺炎組59例，胰腺良性疾病組27例�；诙嘧兞縧ogistic回歸分析，建立了包含8個(gè)基因(APC、BMP3、BNC1、MESTv2、RASSF1A、SFRP1、SFRP2和TFPI2)的預(yù)測(cè)模型(年齡> 65歲)，該模型能夠成功鑒別良惡性病變，靈敏度為76%，特異度為83%。作者強(qiáng)調(diào)了這一預(yù)測(cè)模型與癌癥分期的獨(dú)立性，并得出結(jié)論，認(rèn)為該模型有可能用作胰腺癌的早期血液診斷工具。
隨后，采用相同的28個(gè)基因組、相同的PDAC患者隊(duì)列和相同的實(shí)驗(yàn)方法，只發(fā)現(xiàn)IV期高甲基化基因的平均數(shù)量有非常顯著的差異，但在I、II或III期則沒有，表明在癌癥發(fā)生和進(jìn)展過程中，高甲基化啟動(dòng)子區(qū)域有積累。他們開發(fā)了能夠區(qū)分IV期PDAC患者與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(I、II和III期)，以及可能可切除的PDAC患者(I和II期)與不可切除的PDAC患者(III和IV期)的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。
同樣在2017年，該研究組利用這一隊(duì)列建立了PDAC患者的生存率與血漿來(lái)源的cfDNA中高甲基化基因之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)，cfDNA中有10個(gè)以上高甲基化基因的患者生存率顯著較低，這些基因因胰腺癌分期而異。通過多變量Cox回歸分析建立的最終生存預(yù)測(cè)模型由5個(gè)基因(BNC1、GSTP1、SFRP1、SFRP2和TFPI2)和美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(American Society of Anesthesiologists, ASA)身體狀態(tài)評(píng)分為3分(表明患者患有嚴(yán)重全身性疾病)組成。除SFRP2基因甲基化與較長(zhǎng)的生存期相關(guān)外，其他基因甲基化均與較差的預(yù)后相關(guān)。在Henriksen及其同事所描述的三項(xiàng)研究中，高甲基化被作為定性二元變量進(jìn)行分析，導(dǎo)致了定量信息的丟失。
2021年，這些研究者對(duì)他們之前發(fā)表的PDAC診斷預(yù)測(cè)模型(BMP3、RASSF1A、BNC1、MESTv2、TFPI2、APC、SFRP1和SFRP2)進(jìn)行外部驗(yàn)證，并研究了CA 19 - 9血清對(duì)診斷試驗(yàn)預(yù)測(cè)性能的額外影響。對(duì)346例PDAC(I-IV期)和25例慢性胰腺炎患者的cfDNA樣本進(jìn)行的初始28個(gè)基因panel的MSP結(jié)果顯示，與慢性胰腺炎患者相比，PDAC患者的高甲基化基因數(shù)量較高(8.11 vs. 5.60)。診斷預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證的AUC為0.77，略低于2016年的第一項(xiàng)研究(0.86)。作者解釋說(shuō)主要研究是基于訓(xùn)練數(shù)據(jù)，可能由于過度擬合而高估了測(cè)試表現(xiàn)，從而證明了這一差異。將該檢測(cè)與血清CA19-9值相結(jié)合，AUC為0.85(在主要研究中為0.93)，作者得出結(jié)論，這兩種標(biāo)志物的聯(lián)合使用可以作為臨床上有用的PDAC診斷工具。重要的是要考慮到，除了在驗(yàn)證分析中納入的對(duì)照個(gè)體數(shù)量少之外，病例和對(duì)照在年齡或吸煙方面不匹配，而這兩個(gè)因素都是影響甲基化狀態(tài)的重要因素。
Xiao-Bin Li等人于2019年對(duì)BNC1和SEPT9基因進(jìn)行了重新分析，這些基因先前被描述為胰腺癌癥的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物。qMSP檢測(cè)結(jié)果顯示，在57名PDAC患者、14名PanIN病變患者、44名良性疾病患者和53名健康對(duì)照中，兩個(gè)基因的循環(huán)甲基化水平存在顯著差異，腫瘤患者組的甲基化水平更高。這些標(biāo)志物與CA19-9聯(lián)合用于診斷癌癥的靈敏度和特異性分別為86%和81.1%。然而，這些標(biāo)志物可能在大約1/3的良性胰腺疾病以及其他癌癥中（如結(jié)直腸癌癌癥、癌癥和肝細(xì)胞癌）發(fā)生甲基化。
2020年，Shinjo及其同事進(jìn)行了Illumina Infinium全基因組DNA甲基化分析，靈敏度達(dá)到98%，并指出在有KRAS突變的胰腺癌組織中，ADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A和SPSB4是甲基化最高的基因。隨后使用了一種新型且靈敏的方法(MBD-ddPCR)富集偶聯(lián)甲基化CpG結(jié)合蛋白，并在血清樣本(47例PDAC患者和14例正常對(duì)照)中驗(yàn)證了這5個(gè)標(biāo)記基因的甲基化狀態(tài)。雖然在癌癥患者和對(duì)照之間未觀察到顯著差異，但49%的PDAC患者至少有一個(gè)基因甲基化，因此靈敏度為49%，特異度為86%。cfDNA甲基化狀態(tài)和KRAS突變聯(lián)合應(yīng)用提高了診斷性能，靈敏度為68%，特異度為86%。一個(gè)懸而未決的問題是，如果將一組良性胰腺疾病患者納入研究，將如何比較cfDNA甲基化模式。
2020年，Li和同事使用MeDIP-seq技術(shù)，將免疫沉淀與抗5-甲基胞嘧啶抗體和DNA測(cè)序相結(jié)合，從4例PDAC患者和2例健康對(duì)照cfDNA中的70個(gè)基因中鑒定出143個(gè)高甲基化差異甲基化區(qū)域。在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA和GEO)中使用LASSO法對(duì)143個(gè)候選DMRs進(jìn)行進(jìn)一步分析，篩選出8個(gè)顯著區(qū)分PDAC患者和健康個(gè)體的標(biāo)記物(TRIM73、FAM150A、EPB41L3、SIX3、MIR663、MAPT、LOC100128977和LOC100130148)，靈敏度為97.1%，特異度為98.0%。最后，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，這8個(gè)標(biāo)志物可能作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，但不能作為預(yù)后的指標(biāo)。
Manoochehri及其合作者在2020年描述了SST基因在包括胰腺癌在內(nèi)的各種腫瘤類型中的高甲基化和下調(diào)，作為泛癌癥分子生物標(biāo)志物。結(jié)合對(duì)不同組織樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析的DMRs和先前研究的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示SST是參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞死亡和凋亡以及胃腸道功能的唯一候選基因。通過RRBS測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、qPCR以及對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析，對(duì)PDAC組織樣本中SST基因的高甲基化和低表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，證明SST基因的高甲基化和表達(dá)具有預(yù)后價(jià)值，并與PDAC患者的生存率相關(guān)。此外，與Henriksen等人的觀點(diǎn)一致，在30例PDAC患者和18例健康對(duì)照的血漿樣本中，通過ddPCR對(duì)SST等位基因進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示了較高的診斷靈敏度(93%)和特異度(89%)。然而SST甲基化仍不能作為胰腺癌的特異性標(biāo)志物，而SST高甲基化極有可能作為廣泛腫瘤的血液泛癌生物標(biāo)志物，用于初始分層為高危組和低危組。
Feng Cao等人于2020年開展了5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)測(cè)序和cfMeDIP-seq，以開發(fā)一種穩(wěn)健且無(wú)創(chuàng)的方法，利用cfDNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5hmC標(biāo)志物檢測(cè)PDAC。通過比較5mC和5hmC peaks分布，分別選擇了一組24個(gè)和27個(gè)5mC和5hmC peaks，這些peaks在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中能夠高精度地區(qū)分PDAC組和健康組。結(jié)合5hmC和5mC的綜合預(yù)測(cè)模型顯示出更高的預(yù)測(cè)靈敏度，尤其是在早期PDAC樣本中(綜合模型的靈敏度為87.5%，5mC和5hmC模型的靈敏度分別為75%和62.5%)，支持聯(lián)合應(yīng)用循環(huán)游離5mC和5hmC生物標(biāo)志物進(jìn)行更準(zhǔn)確的腫瘤診斷的可能性。
Majumder等人于2021年開始對(duì)他們之前通過RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)文庫(kù)在PDAC患者組織中鑒定出的13個(gè)甲基化DNA標(biāo)志物進(jìn)行血漿性能分析。使用TELQAS方法分析兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的所有階段PDAC患者(170例)和無(wú)癌癥對(duì)照者(170例)的血漿樣本，包括GRIN2D、CD1D、CLEC11A、AK055957、ZNF781、PRKCB、FER1L4、HOXA1、RYR2、LRRC4、GH05J042948、SHISA9和NTRK3。I期、II期、III期和IV期的靈敏度分別為79%、82%、94%和99%，與CA19-9聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，特異度和靈敏度分別高達(dá)94%和82%。這項(xiàng)工作代表了在PDAC患者中診斷性甲基化生物標(biāo)志物組合的最大研究報(bào)告結(jié)果。然而，本試驗(yàn)應(yīng)納入慢性胰腺炎患者隊(duì)列，以增強(qiáng)上述組合的潛力。
Miller等人基于一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，將ZNF154甲基化作為血液篩查多種癌癥(包括胰腺癌)的合適生物標(biāo)志物。他們利用來(lái)自PDAC和無(wú)癌供體組織樣本的Illumina 450 K甲基化TCGA數(shù)據(jù)分析了ZNF154在特定CG位置的甲基化。此外，他們還使用cBioPortal從這些樣本中收集了突變數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)ZNF4在86.7%的PDAC樣本中呈高甲基化，而在常見的一組PDAC癌基因中有95.3%發(fā)生突變(KRAS中為90.7%，TP53、SMAD4或CDKN2A中為4.6%)。接下來(lái)，他們通過結(jié)合MOB和基于PCR的高分辨率DNA熔解方法(DREAMing)檢測(cè)了血漿樣本中14個(gè)ZNF154 CpG位點(diǎn)(包括Illumina CG位點(diǎn))的甲基化狀態(tài)�？紤]到研究隊(duì)列較小(I-II期8例，III-IV期17例，正常對(duì)照組20例)，對(duì)晚期胰腺的靈敏度為94.1%，特異度為80% (AUC = 0.85)，對(duì)早期胰腺的靈敏度為100%，特異度為80% (AUC = 0.87)。此外，他們觀察到：(I)在早期樣本中未檢測(cè)到KRAS突變cfDNA；(II)晚期PDAC患者中KRAS突變等位基因頻率顯著高于對(duì)照組；(III) AUC為0.67。作者得出結(jié)論，ZNF154顯示出作為基于液體活檢的癌癥篩查實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的良好潛力。建議未來(lái)使用更大的血漿樣本進(jìn)行驗(yàn)證，包括不同的癌癥類型和分期，并建議考慮將該標(biāo)志物納入臨床試驗(yàn)。
最后，利用cfDNA甲基化監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和對(duì)治療的應(yīng)答是胰腺癌中很少討論的一個(gè)重要方面。在這方面，Vrba和同事通過定量MSP分析9例轉(zhuǎn)移性PDAC患者治療前和治療后4周的血液樣本，測(cè)試了一種新的10個(gè)基因DNA甲基化標(biāo)簽評(píng)估腫瘤療效的能力。雖然隊(duì)列和監(jiān)測(cè)時(shí)間有限，但其結(jié)果顯示在所有接受治療的患者中，生物標(biāo)志物信號(hào)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著下降。
本文作者最近的一項(xiàng)研究中使用ddPCR分析了44例轉(zhuǎn)移性PDAC患者血漿中NPTX2甲基化水平，以評(píng)估其在預(yù)后和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展中的作用。驗(yàn)證了循環(huán)NPTX2甲基化水平不僅可以作為有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物，而且可以作為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性PDAC患者的實(shí)用工具。因此，在mPDAC患者中，NPTX2甲基化水平的變化與疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)之間存在相關(guān)性，在預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展方面優(yōu)于CA19-9。此外，在許多情況下，循環(huán)NPTX2甲基化水平的升高先于CT成像發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。
挑戰(zhàn)和結(jié)論
循環(huán)甲基化DNA有望成為胰腺癌檢測(cè)和治療的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物。本文就液體活檢中DNA甲基化作為PDAC診斷或預(yù)后工具的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
液體活檢領(lǐng)域(尤其是在處理cfDNA時(shí))面臨的一個(gè)持續(xù)而緊迫的挑戰(zhàn)是迫切需要對(duì)技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和臨床驗(yàn)證。這對(duì)于從基礎(chǔ)研究過渡到臨床試驗(yàn)范圍并最終推進(jìn)該領(lǐng)域至關(guān)重要。分析的方法學(xué)程序和具體目標(biāo)尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化。因此，為了實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間的一致性，并建立一個(gè)或多個(gè)基因作為臨床適用的基于cfdna的胰腺癌表觀遺傳生物標(biāo)志物，在大量的患者和健康個(gè)體隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證至關(guān)重要。此外，為了便于研究結(jié)果的比較，還需要統(tǒng)一鑒定和檢測(cè)技術(shù)，從而確保所開發(fā)方法的臨床可行性。
另一方面，使用單一生物標(biāo)志物檢測(cè)到的表觀遺傳改變無(wú)法捕捉疾病的復(fù)雜生物學(xué)。從這個(gè)意義上說(shuō)，多種生物標(biāo)志物的聯(lián)合無(wú)疑可以提高預(yù)測(cè)能力，并有助于早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后和治療反應(yīng)。
目前已有47項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究cfDNA甲基化標(biāo)志物在癌癥中的診斷和預(yù)后效用。其中9項(xiàng)研究是關(guān)于胰腺癌中甲基化血液循環(huán)生物標(biāo)志物的驗(yàn)證，而疾病的早期診斷是大多數(shù)(70%)研究的主要目的(圖2)，盡管沒有提供關(guān)于分析哪些基因的具體信息。
圖2：使用cfDNA甲基化治療癌癥的當(dāng)前臨床試驗(yàn)的圖形譜，以及基于cfDNA甲基化的胰腺癌試驗(yàn)的臨床干預(yù)目標(biāo)。
綜上所述，將循環(huán)游離DNA甲基化納入胰腺癌的臨床和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是一個(gè)前景光明的現(xiàn)實(shí)。為此，有必要共同努力，通過更精心設(shè)計(jì)的研究，結(jié)合靈敏度更強(qiáng)或創(chuàng)新技術(shù)的研究，以及增加大規(guī)模臨床試驗(yàn)樣本數(shù)量，來(lái)驗(yàn)證其療效和效用。最后，合作研究和資源共享也可為將這一創(chuàng)新方法納入臨床應(yīng)用鋪平道路。
參考文獻(xiàn)：
García-Ortiz MV, Cano-Ramírez P, Toledano-Fonseca M, Aranda E, Rodríguez-Ariza A. Diagnosing and monitoring pancreatic cancer through cell-free DNA methylation: progress and prospects. Biomark Res. 2023 Oct 5;11(1):88.
背景介紹（Introduction）
胰腺癌是發(fā)達(dá)國(guó)家死亡率第三高的腫瘤，也是3年生存率最低的腫瘤（5%）。胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC）是最常見的胰腺癌類型，占所有病例的80%以上。目前碳水化合物抗原19-9（CA19-9）是胰腺癌臨床診斷中唯一常規(guī)使用的血液生物標(biāo)志物，其靈敏度（79%）和特異性（82%）相對(duì)較低。轉(zhuǎn)移性PDAC患者的CA19-9水平與生存率之間存在關(guān)系。 在臨床實(shí)踐中，對(duì)于疾病過程中CA19-9水平變化的解釋尚未達(dá)成共識(shí)。
因此，開發(fā)基于血液的胰腺癌替代生物標(biāo)志物勢(shì)在必行，這些生物標(biāo)志物有助于早期診斷、精準(zhǔn)分層、選擇適當(dāng)?shù)闹委煼桨�、監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)、評(píng)估治療耐藥性、鑒定微小殘留病灶和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。液體活檢是對(duì)循環(huán)血液成分中的分子生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，已成為克服癌癥診斷和監(jiān)測(cè)挑戰(zhàn)的一種有前景方法(圖1)。通過檢測(cè)和分析血液中循環(huán)游離DNA（cfDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和其他生物標(biāo)志物的基因突變，液體活檢為評(píng)估腫瘤特征和監(jiān)測(cè)治療應(yīng)答提供了一種非侵入性方法。
在癌細(xì)胞中經(jīng)常觀察到異常的DNA甲基化模式變化，這些變化可反映在血液循環(huán)中的cfDNA中。檢測(cè)血流中的這些甲基化變化有望用于早期癌癥檢測(cè)，并有可能通過及時(shí)干預(yù)改善結(jié)局。本文首先對(duì)cfDNA在胰腺癌中的研究進(jìn)行回顧；然后分析了DNA甲基化在胰腺癌背景下的相關(guān)性，總結(jié)cfDNA甲基化的最新研究，特別強(qiáng)調(diào)其臨床效用；最后討論了cfDNA甲基化分析的未來(lái)方向、臨床轉(zhuǎn)化以及將其應(yīng)用到常規(guī)臨床實(shí)踐中的可能性。
循環(huán)cfDNA作為胰腺癌的血液生物標(biāo)志物
那些存在于血液中的DNA片段被稱為循環(huán)游離DNA (cfDNA)，cfDNA可來(lái)源于正常細(xì)胞更新、凋亡或壞死細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞等。在cfDNA中可以檢測(cè)到腫瘤特異性遺傳學(xué)變化，包括基因突變、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)、雜合性丟失(LOH)和異常甲基化模式。cfDNA大小為40~200個(gè)堿基對(duì)(bp)，peak值約為166bp，健康個(gè)體中cfDNA片段長(zhǎng)度中位數(shù)比癌癥患者大。
與腫瘤組織活檢相比，cfDNA不僅更好地描述了腫瘤的完整情況，而且提供了重復(fù)采樣和分析的可能性，從而可以縱向評(píng)估cfDNA濃度的動(dòng)態(tài)變化、鑒定獲得性耐藥突變和監(jiān)測(cè)克隆進(jìn)化。然而將cfDNA作為癌癥的血液生物標(biāo)志物進(jìn)行分析也有一些局限性。cfDNA診斷和預(yù)后效用的一個(gè)重要方面是其血漿低濃度，這使檢測(cè)和分析更為復(fù)雜化。據(jù)估計(jì)，每毫升血漿中約有10-15 ng cfDNA，在大多數(shù)早期癌癥中，循環(huán)腫瘤DNA只占cfDNA的一小部分。這些考慮突出了對(duì)超靈敏檢測(cè)方法的要求。最靈敏的方法是基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法，如BEAMing單分子PCR、TAm-Seq、數(shù)字PCR和微滴數(shù)字PCR。胰腺癌的cfDNA作為一種有前景的早期檢測(cè)和預(yù)后生物標(biāo)志物受到越來(lái)越多關(guān)注。最近的研究表明，80%以上的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者中檢測(cè)到循環(huán)cfDNA的遺傳學(xué)變化，但僅在48%的局限性腫瘤患者中檢測(cè)到。
胰腺癌在雜合性缺失(LOH)情況下，對(duì)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)進(jìn)行的液體活檢研究非常罕見或不存在。Chakrabarti等評(píng)估了使用Guardant360技術(shù)分析了循環(huán)腫瘤DNA中的MSI狀態(tài)可否預(yù)測(cè)PDAC患者對(duì)免疫治療的穩(wěn)健應(yīng)答。結(jié)果表明在83%的患者的組織MSI結(jié)果與血漿G360結(jié)果一致。此外，在1例患者的腫瘤組織中未檢測(cè)到MSI，而血漿中檢測(cè)到MSI。
胰腺癌中最常見的血液生物標(biāo)志物研究包括對(duì)cfDNA循環(huán)突變分析，最常見的突變基因是KRAS、TP53、APC、SMAD4或FBXW7。這些突變與腫瘤中發(fā)現(xiàn)的突變同時(shí)發(fā)生，強(qiáng)調(diào)了cfDNA作為有價(jià)值的胰腺癌血液生物標(biāo)志物的潛力。一些研究已經(jīng)證實(shí)了在循環(huán)cfDNA中檢測(cè)到KRAS突變與局部晚期或轉(zhuǎn)移性PDAC患者的不良預(yù)后相關(guān)。此外，一些研究還將檢測(cè)循環(huán)cfDNA中的KRAS突變作為生物標(biāo)志物，用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和鑒定胰腺癌耐藥的早期跡象。在最近的一項(xiàng)研究中，不可切除胰腺癌患者的cfDNA中存在KRAS突變與不良治療結(jié)果強(qiáng)相關(guān)，并提示這一分子評(píng)估可作為評(píng)估早期腫瘤進(jìn)展的生物標(biāo)志物。
目前的研究強(qiáng)調(diào)了cfDNA作為預(yù)測(cè)PDAC患者預(yù)后有價(jià)值的生物標(biāo)志物來(lái)源潛力。在整個(gè)治療過程中，cfDNA基因圖譜變化可作為治療應(yīng)答或耐藥的早期指標(biāo)，從而為利用生物標(biāo)志物進(jìn)展來(lái)指導(dǎo)治療決策提供了一個(gè)有前景的途徑。
盡管如此，仍然迫切需要推進(jìn)更靈敏技術(shù)的開發(fā)，這些技術(shù)能夠增強(qiáng)對(duì)腫瘤來(lái)源的循環(huán)DNA檢測(cè)，并提高預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。超靈敏技術(shù)結(jié)合和表觀遺傳標(biāo)記(如cfDNA甲基化)的整合為提高胰腺癌cfDNA分析的靈敏度和特異性提供了一個(gè)有希望的機(jī)會(huì)(圖1)。
DNA甲基化與胰腺癌
近年來(lái)，試圖鑒定胰腺癌中甲基化標(biāo)志物的研究越來(lái)越多。DNA甲基化可逆，從治療角度來(lái)看具有很高的研究?jī)r(jià)值。DNA甲基化在CpG二核苷酸胞嘧啶C5位點(diǎn)上添加或移除一個(gè)甲基(CH3)，CpG二核苷酸主要存在于CpG島的特定基因組區(qū)域中。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化模式構(gòu)建主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3 (DNMT3)家族介導(dǎo)，包括DNMT3A和DNMT3B。一旦構(gòu)建，這些模式隨后通過DNMT1作用來(lái)維持。在正常細(xì)胞中，正確DNA甲基化模式保證了基因表達(dá)的正確和精確調(diào)控，并維持穩(wěn)定的基因沉默。因異常甲基化模式被廣泛認(rèn)為是許多類型癌癥的表觀遺傳標(biāo)志，通常在癌癥中觀察到低甲基化和高甲基化事件。具體來(lái)說(shuō)，在基因缺失區(qū)域和重復(fù)序列中，甲基化CpG含量整體下降；從而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，激活先前沉默的致癌基因。癌癥常表現(xiàn)為基因啟動(dòng)子的局部高甲基化，導(dǎo)致抑癌基因的轉(zhuǎn)錄沉默。
目前對(duì)胰腺組織活檢、細(xì)胞系或異種移植模型的大量研究來(lái)解讀胰腺疾病的特異性甲基化模式，以作為胰腺腫瘤的診斷或預(yù)后工具。在胰腺癌中，近80%的病例顯示DNMT1表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致高甲基化。高甲基化被認(rèn)為是胰腺癌中最主要的異常表觀遺傳學(xué)改變。這種異常高甲基化的影響主要在腫瘤抑制基因中觀察到。CDKN2A/p16INK4是胰腺癌中第一個(gè)因啟動(dòng)子異常高甲基化而失活的抑癌基因，它在抑制細(xì)胞周期由G1期向S期進(jìn)展，確保細(xì)胞周期停滯中起著至關(guān)重要的作用。在胰腺外分泌和上皮內(nèi)腫瘤新鮮冷凍組織、人胰腺癌細(xì)胞系和異種移植物中進(jìn)行的其他研究表明，在胰腺癌中，細(xì)胞通過G1期進(jìn)展的其他負(fù)調(diào)控因子，如細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑CDKN1C/p51KIP2和細(xì)胞周期蛋白CCND2的高甲基化和隨后的下調(diào)。在胰腺腫瘤中，由于異常高甲基化而導(dǎo)致表達(dá)降低的其他腫瘤抑制基因包括前腦腦肽原(PENK，在分析的93.3%的腫瘤樣本中高甲基化)、細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制基因1 (SOCS-1, 57.1%)、原鈣黏蛋白10 (PCDH10, 60.9%)、iroquois同源盒4 (IRX4, 64%)和reprimo (RPRM, 57%)等。
胰腺癌中除抑癌基因異常高甲基化外，某些基因也存在異常低甲基化。這種低甲基化主要發(fā)生在特定基因的啟動(dòng)子區(qū)，導(dǎo)致其過表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、存活和侵襲。其中一個(gè)基因是絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINB5 (Maspin)。據(jù)報(bào)道SERPINB5基因在87%的胰腺癌細(xì)胞系(20/23)、94%的異種移植物(32/34)中完全未甲基化，在86%的原發(fā)性胰腺癌(6/7)中低甲基化，該基因甲基化與mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。在臨床樣本中，未甲基化SERPINB5的存在已經(jīng)證明了其作為胰腺腫瘤特異性生物標(biāo)志物的潛力，使胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)與胰腺炎的鑒別成為可能。通過將甲基化和表達(dá)譜數(shù)據(jù)相結(jié)合的多組學(xué)分析，有令人振奮的證據(jù)表明，在胰腺癌組織中，與低甲基化狀態(tài)相關(guān)的特定基因上調(diào)，包括磺基轉(zhuǎn)移酶家族1E成員1 (SULT1E1)、胰島素樣生長(zhǎng)因子2 mRNA結(jié)合蛋白3 (IGF2BP3)和絲裂原活化蛋白4激酶4 (MAP4K4)。這些基因的甲基化和表達(dá)譜變化與胰腺癌患者的總生存期顯著相關(guān)，因此提示它們作為預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在效用。另外幾個(gè)基因在胰腺癌組織中因異常低甲基化而過表達(dá)，包括MUC4、CLDN4、LCN2、SFN、TFF2、S100A4、MSLN和PSCA。
此外，近年來(lái)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)作為一種生物學(xué)功能尚不明確的氧化形式的5mC，作為癌癥診斷和生存的潛在生物標(biāo)志物引起了極大的興趣。一些研究報(bào)道，5hmC水平在人類癌癥中顯著降低，胰腺癌被描述為導(dǎo)致游離細(xì)胞羥甲基化的疾病特異性變化。
綜上所述，表觀遺傳改變?cè)谝认侔┑陌l(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。因此，對(duì)胰腺癌發(fā)生的異常表觀遺傳修飾進(jìn)行綜合分析，對(duì)胰腺癌的分子診斷和治療監(jiān)測(cè)具有重要意義。
胰腺癌cfDNA甲基化研究分析
對(duì)胰腺癌血漿中甲基化生物標(biāo)志物的探索仍處于早期階段，迄今為此開展的研究數(shù)量有限。胰腺癌的cfDNA甲基化模式分析已在全基因組水平以及通過鑒定和描述單個(gè)基因或小基因panel來(lái)進(jìn)行。關(guān)于全基因組測(cè)序方法，已經(jīng)發(fā)表了多項(xiàng)研究。本文主要探究單個(gè)基因或小基因panel作為未來(lái)臨床應(yīng)用的潛在生物標(biāo)志物的效用 (表1)。首項(xiàng)關(guān)于鑒定血漿中胰腺癌甲基化標(biāo)志物的研究始于2007年。Jiao等通過甲基化特異性PCR (MSP)檢測(cè)了83例未經(jīng)治療的胰腺癌患者血漿樣本中ppENK和p16基因的甲基化狀態(tài)。ppENK和p16啟動(dòng)子甲基化率分別為29.3%和24.6%。在83例患者中，9例成對(duì)的胰腺腫瘤組織切片在相同甲基化的腫瘤患者血漿樣本中，p16和ppENK基因的高甲基化率分別為60%和80%。作者得出結(jié)論，血漿DNA在檢測(cè)胰腺癌表觀遺傳學(xué)變化中可能具有替代腫瘤組織的價(jià)值。然而對(duì)于潛在診斷標(biāo)志物而言，所獲得的靈敏度太低，這可能是由于分析的成對(duì)血漿/腫瘤樣本數(shù)量少。此外，本研究缺乏健康人和良性胰腺疾病患者組成的對(duì)照組數(shù)據(jù)。
表1：血漿/血清中游離DNA甲基化作為胰腺癌診斷和/或預(yù)后生物標(biāo)志物的研究
此后不久，另一項(xiàng)開創(chuàng)性研究發(fā)表，表明可以通過使用血漿中循環(huán)cfDNA的甲基化譜來(lái)檢測(cè)胰腺癌。Melnikov等分析了30例PDAC患者和30例年齡匹配的健康志愿者的甲基化特征。當(dāng)時(shí)引入了一種名為MethDet56的新技術(shù)，該研究使用了包含56個(gè)頻繁甲基化基因的芯片檢測(cè)panel。這一創(chuàng)新方法旨在通過甲基化靈敏的核酸內(nèi)切酶消化標(biāo)靶序列，然后使用PCR擴(kuò)增未消化的片段，從而檢測(cè)標(biāo)靶序列的甲基化水平。CCND2、PLAU、SOCS1、THBS和VHL等5個(gè)基因在PDAC患者血漿中的甲基化水平低于健康對(duì)照組，低甲基化模式的靈敏度為76%，特異性為59%。作者將這組基因歸類為復(fù)合生物標(biāo)志物，從而確立了其對(duì)采用基于血漿的方法檢測(cè)胰腺癌的一致預(yù)測(cè)價(jià)值。此外，他們認(rèn)為啟動(dòng)子的非甲基化狀態(tài)在腫瘤檢測(cè)方面更有價(jià)值。然而這些發(fā)現(xiàn)尚未得到后續(xù)研究驗(yàn)證，并且將血漿cfDNA中的低甲基化特定基因用作PDAC的生物標(biāo)志物仍然是一個(gè)有爭(zhēng)議的話題。
同一研究小組使用他們開發(fā)的MethDet56方法，比較30例PDAC患者、30例慢性胰腺炎患者和30例健康對(duì)照者血漿cfDNA甲基化，每組年齡、性別和種族分布相似。為了確定血漿中的特異性甲基化譜，研究者選擇了8個(gè)含信息基因（informative genes ）(BRCA1、CCND2、CDKN1C、MLH1、近端和遠(yuǎn)端PGR啟動(dòng)子區(qū)、SYK和VHL)的啟動(dòng)子，以區(qū)分慢性胰腺炎和健康對(duì)照(靈敏度為78%，特異性為81.7%)。當(dāng)比較慢性胰腺炎和PDAC時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)14個(gè)基因啟動(dòng)子(CCND2、CDKN1C、CDKN2B、DAPK1、ESR1啟動(dòng)子A、MGMT、MLH1、MUC2、MYOD1、PGK1、PGR啟動(dòng)子近端區(qū)域、RARB、RB1和SYK)存在差異甲基化(90.8%靈敏度和91.2%特異性)。14個(gè)基因啟動(dòng)子中有9個(gè)為慢性胰腺炎特異性啟動(dòng)子，5個(gè)為兩組共有。在這組共有的5個(gè)基因中觀察到在慢性胰腺炎中高甲基化的基因在PDAC中低甲基化。
幾年后，MethDet56方法被用于研究PDAC和結(jié)直腸癌(CRC)是否在血漿cfDNA中的共有甲基化標(biāo)志物。7個(gè)基因panel(MDR1、SRBC、VHL、MUC2、RB1、SYK和GPC3)被鑒定為區(qū)分CRC或PDAC與健康對(duì)照的最佳循環(huán)甲基化標(biāo)簽。此外，一項(xiàng)該panel進(jìn)行的限制性更強(qiáng)的分析結(jié)果表明，GPC3是有效區(qū)分PDAC和健康對(duì)照的唯一基因，而VHL和SRBC是PDAC和CRC的信息基因。
Park J.W.等在2012年發(fā)表了兩項(xiàng)研究，使用MSP技術(shù)在血漿中診斷胰腺癌。第一項(xiàng)是初步研究(16例胰腺癌患者，13例慢性胰腺炎患者和29例健康對(duì)照)，該研究使用了6個(gè)候選基因，這些候選基因基于Sato等人2003年在原發(fā)性胰腺癌和正常胰腺導(dǎo)管上皮中獲得的結(jié)果選擇。UCHL1、NPTX2、SARP2、ppENK、p16和RASSF1A基因啟動(dòng)子在PDAC患者和健康對(duì)照之間存在差異甲基化，但p16基因啟動(dòng)子在PDAC患者和慢性胰腺炎患者之間存在差異甲基化。慢性胰腺炎是胰腺癌的已知危險(xiǎn)因素，繼這些結(jié)果和之前從胰腺癌細(xì)胞學(xué)樣本中獲得結(jié)果之后，作者重點(diǎn)研究了一個(gè)更大的血漿隊(duì)列中NPTX2的甲基化狀態(tài)，該隊(duì)列包括104例PDAC患者、60例慢性胰腺炎患者和5例良性膽道結(jié)石患者。NPTX2甲基化在PDAC組中顯著升高(84%的PDAC患者，慢性胰腺炎和良性膽石病組分別為33%和0%;P = 0.016)，其靈敏度和特異性分別為80%和76%，且與腫瘤分期的惡化呈正相關(guān)。
Singh及其合作者于2020年分析了Park等2012年檢測(cè)的6種生物標(biāo)志物中的3種(UCHL1、PENK和NPTX2基因啟動(dòng)子)，并將SPARC基因加入研究。從61例PDAC患者、22例慢性胰腺炎患者和21名健康受試者的cfDNA中通過定量MSP (qMSP)獲得的絕對(duì)拷貝數(shù)計(jì)算基因甲基化指數(shù)(MI)。這4個(gè)基因在PDAC中的MI顯著高于健康對(duì)照組，SPARC MI能夠鑒別早期PDAC和慢性胰腺炎。此外，較高的UCHL1 MI與疾病的晚期相關(guān)；SPARC和NPTX2基因的高M(jìn)I與PDAC的低生存率相關(guān)。
2013年，Kawasaki等利用MSP技術(shù)研究了不同類型癌癥患者（包括47名PDAC患者）cfDNA中細(xì)胞周期相關(guān)基因(APC、DCC、p16、p14、RASSF1A)的甲基化率。RASSF1A和APC的甲基化率最高，分別為34和23.4%，其次為p16和p14。然而本研究缺乏健康對(duì)照組，且RASSF1A甲基化百分比在其他類型的癌癥如肝細(xì)胞癌中相似甚至更高。
同樣在2013年，Yi等通過轉(zhuǎn)錄組微陣列對(duì)4種胰腺癌細(xì)胞系中獲得的1427個(gè)特異性基因進(jìn)行癌癥特異性甲基化過濾后，通過MSP分析了8個(gè)候選基因的甲基化狀態(tài)。bbnc1和ADAMTS1啟動(dòng)子基因在原發(fā)性PDAC腫瘤樣本中表現(xiàn)出最高的甲基化率(分別為91%和67%;n=123)和癌前胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanIN)樣本(分別為70%和25%;n=20)。然后使用甲基化磁珠(Methylation On Beads, MOB)方法在血清樣本(42例PDAC患者和26名健康個(gè)體)中驗(yàn)證這些生物標(biāo)志物，這是一種捕獲、保留和亞硫酸鹽處理微量DNA的納米技術(shù)。在I期PDAC樣本中，BNC1的靈敏度達(dá)到79%，ADAMTS1的靈敏度達(dá)到48%，這兩個(gè)基因的靈敏度均提高至90%。BNC1和ADAMTS1的特異度分別為89%和92%。結(jié)合這兩種基因，檢測(cè)極早期胰腺癌的靈敏度提高(81%)，但特異性未提高(85%)。
9年后，同一組研究人員通過qMSP方法在39例PDAC患者、95例匹配的年齡對(duì)照和8例慢性胰腺炎患者組成的獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了這組有前景的生物標(biāo)志物。在87.2%和65.1%的PDAC病例中檢測(cè)到ADAMTS1和BNC1甲基化，而在非癌癥患者中分別檢測(cè)到4.2%和6.3%。兩基因組合(ADAMTS1和/或BNC1)改善了個(gè)體結(jié)果，在患者和對(duì)照中分別達(dá)到97.4%和8.4%的甲基化水平。該組合也在87.5%慢性胰腺炎樣本中顯示了甲基化，未能區(qū)分PDAC和慢性胰腺炎。在I期、IIA期、IIB期、III期和IV期胰腺癌患者中，ADAMTS1 / BNC1組合的cfDNA甲基化率分別為100%、88.9%、100%，將CA19-9納入分析后，未見明顯改善。根據(jù)這些結(jié)果，作者強(qiáng)調(diào)ADAMTS1和BNC1是在疾病初期階段cfDNA中早期檢測(cè)胰腺癌的可靠標(biāo)志物，這為治愈性腫瘤切除術(shù)提供了治療機(jī)會(huì)。
2021年，為了提高診斷潛力，同一研究組將LRFN5和PXDN基因加入到ADAMTS1/BNC1聯(lián)合甲基化panel中。采用MSP法檢測(cè)106例FFPE組織樣本(44例PDAC (I-IV期)、15例PanIN、24例導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤、15例慢性胰腺炎和8例非癌對(duì)照) 中的甲基化水平，并使用MOB和qMSP檢測(cè)32例血漿(22例PDAC (I-IV期)和10例健康對(duì)照)中甲基化水平。
將LRFN5/PXDN添加到生物標(biāo)志物組中提高了癌前和早期癌癥檢測(cè)的診斷準(zhǔn)確性，AUC為0.94。此外，在血漿中獲得的4個(gè)基因組的靈敏度和特異度分別為100%和90%。本研究納入的人群具有多樣性，增強(qiáng)了研究結(jié)果的廣泛適用性。血漿樣本量明顯小于腫瘤組織樣本量。作者認(rèn)為，cfDNA中4基因組的甲基化頻率與組織中相當(dāng)，盡管較低，可能是由于存在腫瘤異質(zhì)性，這表明這些生物標(biāo)志物基因?qū)δ軌蜓袛U(kuò)散的腫瘤克隆至關(guān)重要。
Henriksen團(tuán)隊(duì)采用了一種獨(dú)特的方法，專注于開發(fā)基于cfDNA甲基化的預(yù)測(cè)模型，用于胰腺癌診斷、生存預(yù)測(cè)和預(yù)后。2016年，Henriksen等人利用優(yōu)化亞硫酸鹽處理方案和兩輪MSP和qMSP(外部和內(nèi)部甲基化特異性引物和探針)評(píng)估了基于之前文獻(xiàn)的發(fā)現(xiàn)選擇的28個(gè)基因panel。共納入95例PDAC患者，其中慢性胰腺炎組97例，急性胰腺炎組59例，胰腺良性疾病組27例�；诙嘧兞縧ogistic回歸分析，建立了包含8個(gè)基因(APC、BMP3、BNC1、MESTv2、RASSF1A、SFRP1、SFRP2和TFPI2)的預(yù)測(cè)模型(年齡> 65歲)，該模型能夠成功鑒別良惡性病變，靈敏度為76%，特異度為83%。作者強(qiáng)調(diào)了這一預(yù)測(cè)模型與癌癥分期的獨(dú)立性，并得出結(jié)論，認(rèn)為該模型有可能用作胰腺癌的早期血液診斷工具。
隨后，采用相同的28個(gè)基因組、相同的PDAC患者隊(duì)列和相同的實(shí)驗(yàn)方法，只發(fā)現(xiàn)IV期高甲基化基因的平均數(shù)量有非常顯著的差異，但在I、II或III期則沒有，表明在癌癥發(fā)生和進(jìn)展過程中，高甲基化啟動(dòng)子區(qū)域有積累。他們開發(fā)了能夠區(qū)分IV期PDAC患者與無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者(I、II和III期)，以及可能可切除的PDAC患者(I和II期)與不可切除的PDAC患者(III和IV期)的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。
同樣在2017年，該研究組利用這一隊(duì)列建立了PDAC患者的生存率與血漿來(lái)源的cfDNA中高甲基化基因之間的相關(guān)性。作者發(fā)現(xiàn)，cfDNA中有10個(gè)以上高甲基化基因的患者生存率顯著較低，這些基因因胰腺癌分期而異。通過多變量Cox回歸分析建立的最終生存預(yù)測(cè)模型由5個(gè)基因(BNC1、GSTP1、SFRP1、SFRP2和TFPI2)和美國(guó)麻醉醫(yī)師協(xié)會(huì)(American Society of Anesthesiologists, ASA)身體狀態(tài)評(píng)分為3分(表明患者患有嚴(yán)重全身性疾病)組成。除SFRP2基因甲基化與較長(zhǎng)的生存期相關(guān)外，其他基因甲基化均與較差的預(yù)后相關(guān)。在Henriksen及其同事所描述的三項(xiàng)研究中，高甲基化被作為定性二元變量進(jìn)行分析，導(dǎo)致了定量信息的丟失。
2021年，這些研究者對(duì)他們之前發(fā)表的PDAC診斷預(yù)測(cè)模型(BMP3、RASSF1A、BNC1、MESTv2、TFPI2、APC、SFRP1和SFRP2)進(jìn)行外部驗(yàn)證，并研究了CA 19 - 9血清對(duì)診斷試驗(yàn)預(yù)測(cè)性能的額外影響。對(duì)346例PDAC(I-IV期)和25例慢性胰腺炎患者的cfDNA樣本進(jìn)行的初始28個(gè)基因panel的MSP結(jié)果顯示，與慢性胰腺炎患者相比，PDAC患者的高甲基化基因數(shù)量較高(8.11 vs. 5.60)。診斷預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證的AUC為0.77，略低于2016年的第一項(xiàng)研究(0.86)。作者解釋說(shuō)主要研究是基于訓(xùn)練數(shù)據(jù)，可能由于過度擬合而高估了測(cè)試表現(xiàn)，從而證明了這一差異。將該檢測(cè)與血清CA19-9值相結(jié)合，AUC為0.85(在主要研究中為0.93)，作者得出結(jié)論，這兩種標(biāo)志物的聯(lián)合使用可以作為臨床上有用的PDAC診斷工具。重要的是要考慮到，除了在驗(yàn)證分析中納入的對(duì)照個(gè)體數(shù)量少之外，病例和對(duì)照在年齡或吸煙方面不匹配，而這兩個(gè)因素都是影響甲基化狀態(tài)的重要因素。
Xiao-Bin Li等人于2019年對(duì)BNC1和SEPT9基因進(jìn)行了重新分析，這些基因先前被描述為胰腺癌癥的潛在循環(huán)生物標(biāo)志物。qMSP檢測(cè)結(jié)果顯示，在57名PDAC患者、14名PanIN病變患者、44名良性疾病患者和53名健康對(duì)照中，兩個(gè)基因的循環(huán)甲基化水平存在顯著差異，腫瘤患者組的甲基化水平更高。這些標(biāo)志物與CA19-9聯(lián)合用于診斷癌癥的靈敏度和特異性分別為86%和81.1%。然而，這些標(biāo)志物可能在大約1/3的良性胰腺疾病以及其他癌癥中（如結(jié)直腸癌癌癥、癌癥和肝細(xì)胞癌）發(fā)生甲基化。
2020年，Shinjo及其同事進(jìn)行了Illumina Infinium全基因組DNA甲基化分析，靈敏度達(dá)到98%，并指出在有KRAS突變的胰腺癌組織中，ADAMTS2、HOXA1、PCDH10、SEMA5A和SPSB4是甲基化最高的基因。隨后使用了一種新型且靈敏的方法(MBD-ddPCR)富集偶聯(lián)甲基化CpG結(jié)合蛋白，并在血清樣本(47例PDAC患者和14例正常對(duì)照)中驗(yàn)證了這5個(gè)標(biāo)記基因的甲基化狀態(tài)。雖然在癌癥患者和對(duì)照之間未觀察到顯著差異，但49%的PDAC患者至少有一個(gè)基因甲基化，因此靈敏度為49%，特異度為86%。cfDNA甲基化狀態(tài)和KRAS突變聯(lián)合應(yīng)用提高了診斷性能，靈敏度為68%，特異度為86%。一個(gè)懸而未決的問題是，如果將一組良性胰腺疾病患者納入研究，將如何比較cfDNA甲基化模式。
2020年，Li和同事使用MeDIP-seq技術(shù)，將免疫沉淀與抗5-甲基胞嘧啶抗體和DNA測(cè)序相結(jié)合，從4例PDAC患者和2例健康對(duì)照cfDNA中的70個(gè)基因中鑒定出143個(gè)高甲基化差異甲基化區(qū)域。在基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(TCGA和GEO)中使用LASSO法對(duì)143個(gè)候選DMRs進(jìn)行進(jìn)一步分析，篩選出8個(gè)顯著區(qū)分PDAC患者和健康個(gè)體的標(biāo)記物(TRIM73、FAM150A、EPB41L3、SIX3、MIR663、MAPT、LOC100128977和LOC100130148)，靈敏度為97.1%，特異度為98.0%。最后，Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明，這8個(gè)標(biāo)志物可能作為胰腺癌早期診斷的潛在生物標(biāo)志物，但不能作為預(yù)后的指標(biāo)。
Manoochehri及其合作者在2020年描述了SST基因在包括胰腺癌在內(nèi)的各種腫瘤類型中的高甲基化和下調(diào)，作為泛癌癥分子生物標(biāo)志物。結(jié)合對(duì)不同組織樣本進(jìn)行全基因組DNA甲基化分析的DMRs和先前研究的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示SST是參與細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、細(xì)胞死亡和凋亡以及胃腸道功能的唯一候選基因。通過RRBS測(cè)序、焦磷酸測(cè)序、qPCR以及對(duì)TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析，對(duì)PDAC組織樣本中SST基因的高甲基化和低表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，證明SST基因的高甲基化和表達(dá)具有預(yù)后價(jià)值，并與PDAC患者的生存率相關(guān)。此外，與Henriksen等人的觀點(diǎn)一致，在30例PDAC患者和18例健康對(duì)照的血漿樣本中，通過ddPCR對(duì)SST等位基因進(jìn)行甲基化分析，結(jié)果顯示了較高的診斷靈敏度(93%)和特異度(89%)。然而SST甲基化仍不能作為胰腺癌的特異性標(biāo)志物，而SST高甲基化極有可能作為廣泛腫瘤的血液泛癌生物標(biāo)志物，用于初始分層為高危組和低危組。
Feng Cao等人于2020年開展了5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)測(cè)序和cfMeDIP-seq，以開發(fā)一種穩(wěn)健且無(wú)創(chuàng)的方法，利用cfDNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5hmC標(biāo)志物檢測(cè)PDAC。通過比較5mC和5hmC peaks分布，分別選擇了一組24個(gè)和27個(gè)5mC和5hmC peaks，這些peaks在訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中能夠高精度地區(qū)分PDAC組和健康組。結(jié)合5hmC和5mC的綜合預(yù)測(cè)模型顯示出更高的預(yù)測(cè)靈敏度，尤其是在早期PDAC樣本中(綜合模型的靈敏度為87.5%，5mC和5hmC模型的靈敏度分別為75%和62.5%)，支持聯(lián)合應(yīng)用循環(huán)游離5mC和5hmC生物標(biāo)志物進(jìn)行更準(zhǔn)確的腫瘤診斷的可能性。
Majumder等人于2021年開始對(duì)他們之前通過RRBS (Reduced Representation Bisulfite Sequencing)文庫(kù)在PDAC患者組織中鑒定出的13個(gè)甲基化DNA標(biāo)志物進(jìn)行血漿性能分析。使用TELQAS方法分析兩個(gè)獨(dú)立隊(duì)列的所有階段PDAC患者(170例)和無(wú)癌癥對(duì)照者(170例)的血漿樣本，包括GRIN2D、CD1D、CLEC11A、AK055957、ZNF781、PRKCB、FER1L4、HOXA1、RYR2、LRRC4、GH05J042948、SHISA9和NTRK3。I期、II期、III期和IV期的靈敏度分別為79%、82%、94%和99%，與CA19-9聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，特異度和靈敏度分別高達(dá)94%和82%。這項(xiàng)工作代表了在PDAC患者中診斷性甲基化生物標(biāo)志物組合的最大研究報(bào)告結(jié)果。然而，本試驗(yàn)應(yīng)納入慢性胰腺炎患者隊(duì)列，以增強(qiáng)上述組合的潛力。
Miller等人基于一項(xiàng)概念驗(yàn)證研究，將ZNF154甲基化作為血液篩查多種癌癥(包括胰腺癌)的合適生物標(biāo)志物。他們利用來(lái)自PDAC和無(wú)癌供體組織樣本的Illumina 450 K甲基化TCGA數(shù)據(jù)分析了ZNF154在特定CG位置的甲基化。此外，他們還使用cBioPortal從這些樣本中收集了突變數(shù)據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)ZNF4在86.7%的PDAC樣本中呈高甲基化，而在常見的一組PDAC癌基因中有95.3%發(fā)生突變(KRAS中為90.7%，TP53、SMAD4或CDKN2A中為4.6%)。接下來(lái)，他們通過結(jié)合MOB和基于PCR的高分辨率DNA熔解方法(DREAMing)檢測(cè)了血漿樣本中14個(gè)ZNF154 CpG位點(diǎn)(包括Illumina CG位點(diǎn))的甲基化狀態(tài)�？紤]到研究隊(duì)列較小(I-II期8例，III-IV期17例，正常對(duì)照組20例)，對(duì)晚期胰腺的靈敏度為94.1%，特異度為80% (AUC = 0.85)，對(duì)早期胰腺的靈敏度為100%，特異度為80% (AUC = 0.87)。此外，他們觀察到：(I)在早期樣本中未檢測(cè)到KRAS突變cfDNA；(II)晚期PDAC患者中KRAS突變等位基因頻率顯著高于對(duì)照組；(III) AUC為0.67。作者得出結(jié)論，ZNF154顯示出作為基于液體活檢的癌癥篩查實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的良好潛力。建議未來(lái)使用更大的血漿樣本進(jìn)行驗(yàn)證，包括不同的癌癥類型和分期，并建議考慮將該標(biāo)志物納入臨床試驗(yàn)。
最后，利用cfDNA甲基化監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和對(duì)治療的應(yīng)答是胰腺癌中很少討論的一個(gè)重要方面。在這方面，Vrba和同事通過定量MSP分析9例轉(zhuǎn)移性PDAC患者治療前和治療后4周的血液樣本，測(cè)試了一種新的10個(gè)基因DNA甲基化標(biāo)簽評(píng)估腫瘤療效的能力。雖然隊(duì)列和監(jiān)測(cè)時(shí)間有限，但其結(jié)果顯示在所有接受治療的患者中，生物標(biāo)志物信號(hào)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著下降。
本文作者最近的一項(xiàng)研究中使用ddPCR分析了44例轉(zhuǎn)移性PDAC患者血漿中NPTX2甲基化水平，以評(píng)估其在預(yù)后和監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展中的作用。驗(yàn)證了循環(huán)NPTX2甲基化水平不僅可以作為有價(jià)值的預(yù)后生物標(biāo)志物，而且可以作為監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)移性PDAC患者的實(shí)用工具。因此，在mPDAC患者中，NPTX2甲基化水平的變化與疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)之間存在相關(guān)性，在預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展方面優(yōu)于CA19-9。此外，在許多情況下，循環(huán)NPTX2甲基化水平的升高先于CT成像發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展。
挑戰(zhàn)和結(jié)論
循環(huán)甲基化DNA有望成為胰腺癌檢測(cè)和治療的無(wú)創(chuàng)生物標(biāo)志物。本文就液體活檢中DNA甲基化作為PDAC診斷或預(yù)后工具的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。
液體活檢領(lǐng)域(尤其是在處理cfDNA時(shí))面臨的一個(gè)持續(xù)而緊迫的挑戰(zhàn)是迫切需要對(duì)技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和臨床驗(yàn)證。這對(duì)于從基礎(chǔ)研究過渡到臨床試驗(yàn)范圍并最終推進(jìn)該領(lǐng)域至關(guān)重要。分析的方法學(xué)程序和具體目標(biāo)尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化。因此，為了實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室間的一致性，并建立一個(gè)或多個(gè)基因作為臨床適用的基于cfdna的胰腺癌表觀遺傳生物標(biāo)志物，在大量的患者和健康個(gè)體隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證至關(guān)重要。此外，為了便于研究結(jié)果的比較，還需要統(tǒng)一鑒定和檢測(cè)技術(shù)，從而確保所開發(fā)方法的臨床可行性。
另一方面，使用單一生物標(biāo)志物檢測(cè)到的表觀遺傳改變無(wú)法捕捉疾病的復(fù)雜生物學(xué)。從這個(gè)意義上說(shuō)，多種生物標(biāo)志物的聯(lián)合無(wú)疑可以提高預(yù)測(cè)能力，并有助于早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后和治療反應(yīng)。
目前已有47項(xiàng)臨床試驗(yàn)研究cfDNA甲基化標(biāo)志物在癌癥中的診斷和預(yù)后效用。其中9項(xiàng)研究是關(guān)于胰腺癌中甲基化血液循環(huán)生物標(biāo)志物的驗(yàn)證，而疾病的早期診斷是大多數(shù)(70%)研究的主要目的(圖2)，盡管沒有提供關(guān)于分析哪些基因的具體信息。
圖2：使用cfDNA甲基化治療癌癥的當(dāng)前臨床試驗(yàn)的圖形譜，以及基于cfDNA甲基化的胰腺癌試驗(yàn)的臨床干預(yù)目標(biāo)。
- 數(shù)據(jù)指的是47個(gè)臨床試驗(yàn)中針對(duì)不同癌癥類型的67項(xiàng)研究。
- 數(shù)據(jù)指的是了9項(xiàng)胰腺癌臨床試驗(yàn)中的13項(xiàng)不同終點(diǎn)的研究。
綜上所述，將循環(huán)游離DNA甲基化納入胰腺癌的臨床和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是一個(gè)前景光明的現(xiàn)實(shí)。為此，有必要共同努力，通過更精心設(shè)計(jì)的研究，結(jié)合靈敏度更強(qiáng)或創(chuàng)新技術(shù)的研究，以及增加大規(guī)模臨床試驗(yàn)樣本數(shù)量，來(lái)驗(yàn)證其療效和效用。最后，合作研究和資源共享也可為將這一創(chuàng)新方法納入臨床應(yīng)用鋪平道路。
參考文獻(xiàn)：
García-Ortiz MV, Cano-Ramírez P, Toledano-Fonseca M, Aranda E, Rodríguez-Ariza A. Diagnosing and monitoring pancreatic cancer through cell-free DNA methylation: progress and prospects. Biomark Res. 2023 Oct 5;11(1):88.
標(biāo)簽：
cfDNA
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