DNA甲基化技術(shù)及其優(yōu)劣勢(shì)比較

全基因組甲基化研究策略
一、甲基化芯片

以Illumina的450K芯片為例，該芯片采用兩種分析：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有兩種bead（微珠），分別是甲基化M和非甲基化U，后者則是一種bead（不區(qū)分甲基化和非甲基化）。

如圖A：Infinium I，在未甲基化的GpC locus，U型bead尾部為A，與未甲基化CpG位點(diǎn)相匹配，能夠成功進(jìn)行單核苷酸延伸并被檢測(cè)到（U型磁珠發(fā)光），而M型bead尾部為G，與未甲基化位點(diǎn)不能匹配，沒(méi)有信號(hào)產(chǎn)生；在甲基化的GpC locus，M型bead能與甲基化CpG位點(diǎn)相匹配，單核苷酸延伸并產(chǎn)生信號(hào)（M型磁珠發(fā)光），而U型bead則不匹配，不產(chǎn)生信號(hào)

如圖B：Infinium Ⅱ探針則不區(qū)分M和U，探針尾部為C，配對(duì)后只加入單個(gè)堿基（ddNTP-BioT， ddNTP-DNP），然后根據(jù)熒光顏色判斷加入堿基的類型，進(jìn)而確定該位點(diǎn)是否被甲基化

探針長(zhǎng)度為50bp，基于假設(shè)在50bp內(nèi)的CpG位點(diǎn)具有相同的甲基化狀態(tài)，具有區(qū)域相關(guān)性

通過(guò)計(jì)算甲基化和非甲基化位點(diǎn)的熒光信號(hào)比例，可確定某位點(diǎn)的甲基化水平（Beta值=M/(M+UM)

二、WGBS

三、簡(jiǎn)化亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)（RRBS）

RRBS(Reduced representation bisulfite sequencing) ，即簡(jiǎn)并代表性亞硫酸氫鹽測(cè)序技術(shù)。是一種用于基因組單核苷酸級(jí)別的甲基化水平分析的高效的高通量測(cè)序技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了限制性內(nèi)切酶和亞硫酸氫鹽測(cè)序，從而得到高CpG區(qū)域的富集信息。相比較全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)，RRBS僅需要對(duì)基因組約1%的區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，因此費(fèi)用大大降低。

技術(shù)流程

1. 酶切；2.末端補(bǔ)齊；3.測(cè)序文庫(kù)制備；4.純化；5.亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化；6.PCR擴(kuò)增；7.PCR純化；8.測(cè)序；9.測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)與分析

甲基化芯片

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測(cè)，信息量大；在人中有效檢測(cè)和生物學(xué)時(shí)間相關(guān)區(qū)域的甲基化；

缺點(diǎn)：芯片雜交要求的設(shè)備昂貴；芯片限于人的樣本；只能覆蓋有限的CpG位點(diǎn)。

WGBS

優(yōu)點(diǎn)：通量高 ，全基因組范圍；單堿基分辨率；

缺點(diǎn)：成本高，不適于大樣本研究分析；不適于特異位點(diǎn)、基因或區(qū)段研究。

RRBS

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測(cè)；分辨率達(dá)到CpG水平；不依賴限制性位點(diǎn)；樣本被精簡(jiǎn)過(guò)，導(dǎo)致測(cè)序成本低；

缺點(diǎn)：雖然降低了成本，但價(jià)格仍然較高；對(duì)甲基化CpG覆蓋程度有限；目的不夠明確；基因組覆蓋不全容易遺漏一些關(guān)鍵的區(qū)間。

特異位點(diǎn)甲基化研究策略
一、甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶

優(yōu)點(diǎn)：相對(duì)簡(jiǎn)單,成本低廉，甲基化位點(diǎn)明確,實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋；

缺點(diǎn)：

1.由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略；

2.只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí),該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意義；

3.相對(duì)而言，Southern方法較復(fù)雜，且需要樣本的量大；

4.存在著酶不完全消化引起的假陽(yáng)性的問(wèn)題;

5.不適用于混合樣本；

6.雜交需要放射性標(biāo)記；

7.覆蓋有限的CpG位點(diǎn)。

二、Bisulfite sequencing PCR (BSP)

基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)BSP引物擴(kuò)增目的片段，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并選取8-10個(gè)轉(zhuǎn)化子序列，即可確定所研究的CpG區(qū)域的甲基化頻率。

優(yōu)點(diǎn)：可定性和定量檢測(cè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)；片段有效長(zhǎng)度較長(zhǎng)；

缺點(diǎn)：通量低；成本高（測(cè)序成本和未轉(zhuǎn)化對(duì)照）；實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)；直接測(cè)序信號(hào)質(zhì)量差，克隆測(cè)序操作繁瑣，不宜大批量操作。

三、Methylation specific PCR (MSP)

首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，然后針對(duì)甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。

優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，操作方便，經(jīng)濟(jì)適用，節(jié)約時(shí)間；

缺點(diǎn)：只能定性，不可定量（半定量），特異性低；需要參考序列，引物設(shè)計(jì)非常重要；若待測(cè)DNA中5mC分布極不均衡，檢測(cè)結(jié)果較為復(fù)雜。

四、焦磷酸測(cè)序 五、飛行質(zhì)譜法

優(yōu)點(diǎn)：不依賴于限制性位點(diǎn)；分析片段比焦磷酸測(cè)序長(zhǎng)200-600bp；檢測(cè)模板量低至20ng；可確定單一位點(diǎn)甲基化程度；靈敏度可低至5%；

缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)有時(shí)候較難；硬件昂貴；實(shí)驗(yàn)復(fù)雜、耗時(shí)，人為干預(yù)程度高，如PCR反應(yīng)均應(yīng)設(shè)空白對(duì)照和已知陽(yáng)性對(duì)照，PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜儀進(jìn)行甲基化檢測(cè)時(shí)設(shè)置完全非甲基化樣本和完全甲基化樣本進(jìn)行對(duì)照，需要操作規(guī)范，防止加樣交叉污染等才能確保結(jié)果真實(shí)性；經(jīng)過(guò)2次處理，1次酶切，如處理和酶切不完全，則結(jié)果受影響較大。

六、MeDIP-chip/seq

MeDIP-chip

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測(cè)；不依賴限制性位點(diǎn)

缺點(diǎn)：抗體和微陣列需求的儀器昂貴；分辨率

MeDIP-seq

優(yōu)點(diǎn)：在全基因組尺度檢測(cè)；分辨率達(dá)到CpG水平；不依賴限制性位點(diǎn)，覆蓋范圍廣；樣本被富集過(guò)，導(dǎo)致測(cè)序成本低；

缺點(diǎn)：抗體特異性要求高；測(cè)序成本高；對(duì)于區(qū)分甲基化區(qū)域來(lái)說(shuō)，和同等方法相比不夠強(qiáng)大

靶向甲基化重測(cè)序

翼和策略：目標(biāo)區(qū)間甲基化重測(cè)序（Hi-MethylSeq）

技術(shù)路線：

優(yōu)勢(shì)：Hi-Methylseq結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析。

應(yīng)用：1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽(yáng)性位點(diǎn)。

文獻(xiàn)：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160