Cell文獻(xiàn)解讀：中國科學(xué)家成功構(gòu)建胚胎干細(xì)胞嵌合體猴
北京時間2023年11月9日，《Cell》期刊以封面文章的形式在線發(fā)表了由中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心(神經(jīng)科學(xué)研究所)、上海腦科學(xué)與類腦研究中心，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院等單位牽頭，題為《Live birth of chimeric monkey with high contribution from embryonic stem cells》(高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴)的研究論文，該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實了猴胚胎干細(xì)胞可以高效地貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。
此外，經(jīng)RNA測序(RNA-seq)檢測，在所有轉(zhuǎn)化的ESC中，多個原始ESC富集基因下調(diào)，而在4CL和5iLAF ESC中，原始多能性網(wǎng)絡(luò)被更強(qiáng)地激活。基因本體(GO)分析顯示，在4CL和5iLAF ESCs中，與干細(xì)胞群體維持和DNA修飾相關(guān)的基因表達(dá)豐富，而在PXGL ESCs中，軸突導(dǎo)向和神經(jīng)分化相關(guān)基因表達(dá)豐富。這些結(jié)果表明，4CL和5iLAF ESCs的原始狀態(tài)穩(wěn)定，但PXGL ESCs的幼稚狀態(tài)不穩(wěn)定，這反映了物種對這種培養(yǎng)基反應(yīng)的特異性差異。然后，此研究通過基于液滴的單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)研究了猴子的原始ESCs和在4CL、5iLAF和PXGL培養(yǎng)的ESCs的發(fā)育狀態(tài)。相關(guān)性分析和均勻流形近似與投影(UMAP)顯示，4CL和5iLAF ESCs更接近于ICM和植入前的上胚層，primed ESCs更接近于植入后晚期的上胚層，而PXGL ESCs則同時位于這兩個分組中(圖1)。
由于DNA去甲基化是一種表觀遺傳學(xué)機(jī)制，通過這種機(jī)制，原始ESC可轉(zhuǎn)化為幼稚多能狀態(tài)，因此研究進(jìn)行了微量DNA全基因組亞硫酸氫鹽測序(Micro-WGBS)。結(jié)果表明，在RSeT、PXGL和LCDM中培養(yǎng)的ESCs的DNA甲基化水平較高(83%-86%)，與原始ESCs的水平相似；4CLESCs的水平較低(72%)，而5iLAFESCs的水平最低(52%)，4CL和5iLAFESCs顯示的印記基因DNA甲基化模式與ICM更為接近(圖2)。
圖2. 在不同條件下以及不同培養(yǎng)期猴ESCs的表觀基因組特征
此研究還在4CL原始轉(zhuǎn)化的不同階段進(jìn)行了全基因組甲基化分析，發(fā)現(xiàn)包括原始多能基因位點(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在內(nèi)的所有基因組元件都出現(xiàn)了漸進(jìn)的DNA去甲基化現(xiàn)象。另外，在4CL原始轉(zhuǎn)換的不同時期進(jìn)行了甲基化測序，發(fā)現(xiàn)包括原始多能基因位點(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在內(nèi)的所有基因組元件都出現(xiàn)了逐漸的DNA去甲基化過程。此外，在轉(zhuǎn)化過程中，一些印記基因的啟動子區(qū)域也檢測到了動態(tài)去甲基化(圖3)。
圖3. 在1、3、7和10個傳代的原始條件和4CL原始條件下培養(yǎng)的ESC，在不同基因組區(qū)域，原始多能基因，原始多能性位點以及印記基因啟動子區(qū)域的DNA甲基化水平。
以上研究證明了與在其他人類造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的猴子造血干細(xì)胞相比，4CL造血干細(xì)胞顯示出更均衡的全基因組DNA去甲基化，同時具有原始多能基因的高表達(dá)水平和基因組穩(wěn)定性。
為了提高注射早期猴胚胎中ESC的存活率，此研究對4CL造血干細(xì)胞的培養(yǎng)方案進(jìn)行了優(yōu)化并將體外培養(yǎng)干細(xì)胞注射到早期胚胎中形成嵌合猴胚胎，移植到代孕雌猴體內(nèi)，成功培育出了活產(chǎn)嵌合體。在確認(rèn)代孕雌猴懷孕的12例妊娠中，有4例流產(chǎn)胎兒和6例足月活產(chǎn)后代，其中包含一個流產(chǎn)的男胎(9號)和一個活產(chǎn)的男胎(10號)。而DNA甲基化水平異常是導(dǎo)致小鼠嵌合不良的一個眾所周知的原因，為了深入了解9號嵌合猴流產(chǎn)和10號活產(chǎn)嵌合猴健康受損的情況，此研究選擇ESC分化的和宿主胚胎分化的GFP序列信號陽性(GFP+)和GFP序列信號陰性(GFP-)的-成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(BMCs)進(jìn)行了微量全基因組甲基化測序(Micro-WGBS)以研究表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。
GFP+BMCs的DNA甲基化水平(約80%)高于GFP-BMCs(約72%)這種高甲基化分布在不同的基因組區(qū)域。在GFP+和GFP- BMCs之間共鑒定出18,462個不同的甲基化區(qū)域，顯示出高甲基化(hyperDMRs)，其中9%在啟動子區(qū)域，870個顯示出低甲基化(hypoDMRs)。對這些hyperDMRs對應(yīng)的基因進(jìn)行的GO分析表明，這些基因富集于與發(fā)育相關(guān)的生物過程，如解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生和系統(tǒng)發(fā)育。在與BMC相關(guān)的發(fā)育術(shù)語方面沒有觀察到實質(zhì)性的富集。BMC中前100個表達(dá)基因啟動子中的DNA甲基化水平在GFP+和GFP-BMC之間無顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)與GFP+和GFP- BMCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相當(dāng)相似。此研究還分析了印記基因的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)GFP+BMCs印記基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平略高。同時，此研究發(fā)現(xiàn)這些印記基因在GFP+和GFP-BMCs中的表達(dá)水平相似，這表明在用4CL ESCs生成的猴嵌合體中沒有明顯的基因組印記缺失，且與此研究觀察到的猴原始ESCs中的DNA甲基化水平大大高于ICM中的DNA甲基化水平是一致的（圖4）。
此論文的通訊作者，中國科學(xué)院腦智卓越中心劉真研究員、孫強(qiáng)研究員和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究員表示該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實了猴胚胎干細(xì)胞可以高效的貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。這對于理解靈長類胚胎干細(xì)胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
Cao, Jing, Wenjuan Li, Jie Li, Md. Abdul Mazid, Chunyang Li, Yu Jiang, Wenqi Jia, et al. ‘Live Birth of Chimeric Monkey with High Contribution from Embryonic Stem Cells’. Cell 186, no. 23 (November 2023): 4996-5014.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.005.
首先，研究者首先利用之前報道的人類原始造血干細(xì)胞(ESC)的提取方案，從17個E7(胚胎第7天)擴(kuò)增囊胚中建立了9個猴原始造血干細(xì)胞系。之后選擇了四種人類多能干細(xì)胞(PSC)培養(yǎng)基進(jìn)行原始細(xì)胞到多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：RSeT(基于NHSM24)、5iLAF、PXGL和4CL。此外，此研究還引入了LCDM，它可產(chǎn)生人類擴(kuò)展?jié)撃芨杉?xì)胞，這是一種分化能力更強(qiáng)的PSC。在每種條件下，此研究使用了5個引物猴ESC株系(2個雄性和3個雌性)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。所有條件下的克隆均在2-4個傳代內(nèi)都出現(xiàn)了圓頂形形態(tài)(類似小鼠原始態(tài)胚胎干細(xì)胞)，但RSeT的形態(tài)變化較小，且使用4CL、RSeT和LCDM可將全部5個引物猴ESC株系成功轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的PSC，且經(jīng)過20多次傳代后表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落形態(tài)。定量RT-PCR(RT-qPCR)分析表明，所有轉(zhuǎn)化的ESC株系都表達(dá)經(jīng)典的多能基因，其水平與原始ESCs相當(dāng)。在所有轉(zhuǎn)化的ESCs中，原始多能性基因的表達(dá)水平都不同程度地高于原始ESCs，其中在5iLAF和4CL培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)水平最高。KLF17、SOX2和NANOG的免疫染色進(jìn)一步證實了這些發(fā)現(xiàn)。
此外，經(jīng)RNA測序(RNA-seq)檢測，在所有轉(zhuǎn)化的ESC中，多個原始ESC富集基因下調(diào)，而在4CL和5iLAF ESC中，原始多能性網(wǎng)絡(luò)被更強(qiáng)地激活。基因本體(GO)分析顯示，在4CL和5iLAF ESCs中，與干細(xì)胞群體維持和DNA修飾相關(guān)的基因表達(dá)豐富，而在PXGL ESCs中，軸突導(dǎo)向和神經(jīng)分化相關(guān)基因表達(dá)豐富。這些結(jié)果表明，4CL和5iLAF ESCs的原始狀態(tài)穩(wěn)定，但PXGL ESCs的幼稚狀態(tài)不穩(wěn)定，這反映了物種對這種培養(yǎng)基反應(yīng)的特異性差異。然后，此研究通過基于液滴的單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)研究了猴子的原始ESCs和在4CL、5iLAF和PXGL培養(yǎng)的ESCs的發(fā)育狀態(tài)。相關(guān)性分析和均勻流形近似與投影(UMAP)顯示，4CL和5iLAF ESCs更接近于ICM和植入前的上胚層，primed ESCs更接近于植入后晚期的上胚層，而PXGL ESCs則同時位于這兩個分組中(圖1)。
圖1. 在指定條件下培養(yǎng)的ESCs的免疫熒光圖像以及原始多能性基因的表達(dá)水平和相關(guān)性特征。
由于DNA去甲基化是一種表觀遺傳學(xué)機(jī)制，通過這種機(jī)制，原始ESC可轉(zhuǎn)化為幼稚多能狀態(tài)，因此研究進(jìn)行了微量DNA全基因組亞硫酸氫鹽測序(Micro-WGBS)。結(jié)果表明，在RSeT、PXGL和LCDM中培養(yǎng)的ESCs的DNA甲基化水平較高(83%-86%)，與原始ESCs的水平相似；4CLESCs的水平較低(72%)，而5iLAFESCs的水平最低(52%)，4CL和5iLAFESCs顯示的印記基因DNA甲基化模式與ICM更為接近(圖2)。
圖2. 在不同條件下以及不同培養(yǎng)期猴ESCs的表觀基因組特征
此研究還在4CL原始轉(zhuǎn)化的不同階段進(jìn)行了全基因組甲基化分析，發(fā)現(xiàn)包括原始多能基因位點(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在內(nèi)的所有基因組元件都出現(xiàn)了漸進(jìn)的DNA去甲基化現(xiàn)象。另外，在4CL原始轉(zhuǎn)換的不同時期進(jìn)行了甲基化測序，發(fā)現(xiàn)包括原始多能基因位點(KLF17、DPPA3和DNMT3L3)在內(nèi)的所有基因組元件都出現(xiàn)了逐漸的DNA去甲基化過程。此外，在轉(zhuǎn)化過程中，一些印記基因的啟動子區(qū)域也檢測到了動態(tài)去甲基化(圖3)。
以上研究證明了與在其他人類造血干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)的猴子造血干細(xì)胞相比，4CL造血干細(xì)胞顯示出更均衡的全基因組DNA去甲基化，同時具有原始多能基因的高表達(dá)水平和基因組穩(wěn)定性。
為了提高注射早期猴胚胎中ESC的存活率，此研究對4CL造血干細(xì)胞的培養(yǎng)方案進(jìn)行了優(yōu)化并將體外培養(yǎng)干細(xì)胞注射到早期胚胎中形成嵌合猴胚胎，移植到代孕雌猴體內(nèi)，成功培育出了活產(chǎn)嵌合體。在確認(rèn)代孕雌猴懷孕的12例妊娠中，有4例流產(chǎn)胎兒和6例足月活產(chǎn)后代，其中包含一個流產(chǎn)的男胎(9號)和一個活產(chǎn)的男胎(10號)。而DNA甲基化水平異常是導(dǎo)致小鼠嵌合不良的一個眾所周知的原因，為了深入了解9號嵌合猴流產(chǎn)和10號活產(chǎn)嵌合猴健康受損的情況，此研究選擇ESC分化的和宿主胚胎分化的GFP序列信號陽性(GFP+)和GFP序列信號陰性(GFP-)的-成纖維細(xì)胞和骨髓細(xì)胞(BMCs)進(jìn)行了微量全基因組甲基化測序(Micro-WGBS)以研究表觀遺傳學(xué)狀態(tài)。
GFP+BMCs的DNA甲基化水平(約80%)高于GFP-BMCs(約72%)這種高甲基化分布在不同的基因組區(qū)域。在GFP+和GFP- BMCs之間共鑒定出18,462個不同的甲基化區(qū)域，顯示出高甲基化(hyperDMRs)，其中9%在啟動子區(qū)域，870個顯示出低甲基化(hypoDMRs)。對這些hyperDMRs對應(yīng)的基因進(jìn)行的GO分析表明，這些基因富集于與發(fā)育相關(guān)的生物過程，如解剖結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生和系統(tǒng)發(fā)育。在與BMC相關(guān)的發(fā)育術(shù)語方面沒有觀察到實質(zhì)性的富集。BMC中前100個表達(dá)基因啟動子中的DNA甲基化水平在GFP+和GFP-BMC之間無顯著差異。這些發(fā)現(xiàn)與GFP+和GFP- BMCs的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相當(dāng)相似。此研究還分析了印記基因的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)GFP+BMCs印記基因啟動子區(qū)的DNA甲基化水平略高。同時，此研究發(fā)現(xiàn)這些印記基因在GFP+和GFP-BMCs中的表達(dá)水平相似，這表明在用4CL ESCs生成的猴嵌合體中沒有明顯的基因組印記缺失，且與此研究觀察到的猴原始ESCs中的DNA甲基化水平大大高于ICM中的DNA甲基化水平是一致的（圖4）。
圖4. GFP+BMC和GFP-BMC整體、TSS,TES，不同基因組區(qū)域的DNA甲基化水平以及GFP+BMC在整個注釋基因組中高甲基化區(qū)域分布，啟動子區(qū)域DNA甲基化水平與BMC表達(dá)基因與印記基因的表達(dá)水平聚類熱圖
此論文的通訊作者，中國科學(xué)院腦智卓越中心劉真研究員、孫強(qiáng)研究員和中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院Miguel A. Esteban研究員表示該研究在國際上首次成功構(gòu)建了高比例胚胎干細(xì)胞貢獻(xiàn)的出生存活嵌合體猴，并證實了猴胚胎干細(xì)胞可以高效的貢獻(xiàn)到胚外胎盤組織和生殖細(xì)胞。這對于理解靈長類胚胎干細(xì)胞全能性具有重要意義，為遺傳修飾模型猴的構(gòu)建奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。
參考文獻(xiàn)：
Cao, Jing, Wenjuan Li, Jie Li, Md. Abdul Mazid, Chunyang Li, Yu Jiang, Wenqi Jia, et al. ‘Live Birth of Chimeric Monkey with High Contribution from Embryonic Stem Cells’. Cell 186, no. 23 (November 2023): 4996-5014.e24. https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.10.005.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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