oxBS揭示口腔鱗癌的啟動子區(qū)甲基化和羥甲基化變化及基因差異表達
口腔鱗狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma, OSCC)是世界范圍內最常見的癌癥類型之一。盡管已有研究表明5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)在口腔鱗狀細胞癌中的整體缺失，但對OSCC中5mC和5hmC進行全基因組、單堿基分辨和同時定位仍未完成。同樣，5mC和5hmC如何共同導致OSCC基因異常表達的機制尚未完全闡明。
2023年10月12日，南華大學王丹玲教授和萬正卿為共同通訊作者在《Front Genet》雜志發(fā)表題為“Unidirectional alteration of methylation and hydroxymethylation at the promoters and differential gene expression in oral squamous cell carcinoma”的研究論文，該研究利用平行全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)和全基因組氧化亞硫酸氫測序(oxWGBS)，在成對原發(fā)口腔鱗狀細胞癌樣本及其正常癌旁組織(NATs)中以單核苷酸分辨率表征5mC和5hmC圖譜，并采用多組學方法分析5mC和5hmc修飾對OSCC差異基因表達的影響。
研究摘要：
本研究通過oxWGBS+WGBS在OSCC樣品中觀察到不同基因組區(qū)域的5mC和5hmC整體水平降低。在啟動子區(qū)域，OSCC中共鑒定出6921個差異甲基化區(qū)域和1024個差異羥甲基化區(qū)域。與5mC和5hmC共修飾相比，在啟動子區(qū)域5mC和5hmC單修飾與基因表達更大變化相關。此外，啟動子區(qū)域5mC和5hmC單修飾基因在細胞增殖、細胞分化和受體酪氨酸激酶通路等信號通路中富集，這些通路對腫瘤發(fā)生至關重要。最后，具有5mC和5hmC啟動子單修飾的前20個基因分組表達特征往往與某些亞型頭頸部鱗狀細胞癌的臨床結局相關。
研究結果表明使用平行WGBS和oxWGBS分析揭示了OSCC不同基因組區(qū)域的5mC和5hmC修飾整體減少。啟動子區(qū)域5mC和5hmC的單修飾與OSCC組織中基因表達的增強變化有關。此外這種在啟動子區(qū)域的5mC和5hmC單修飾差異表達基因可能與OSCC的臨床結局具有相關性。
結果圖形：
（1）5mC和5hmC在全基因組中的分布
表1：WGBS和oxWGBS文庫測序概況
表2：WGBS和oxWGBS文庫中的亞硫酸鹽和氧化亞硫酸鹽轉化率
表3：WGBS和oxWGBS文庫中不同胞嘧啶序列數(shù)量和平均甲基化率。
（2）5mC和5hmC在基因組區(qū)域中的分布
圖2：5mC和5hmC在基因調控元件中的分布。
（3）啟動子DMRs和DhMR鑒定
圖3：p-DMRs和p-DhMRs的鑒定
（4）甲基化、羥甲基化與基因表達的綜合分析
圖4：5mC、5hmC與基因表達的綜合分析
（5）啟動子5mC和5hmC單修飾OSCC差異表達基因的功能分析
C–D. Kaplan-Meier曲線顯示了上述前20個上調基因標簽(C)和前20個下調基因標簽(D)
E-F. 低或高評分的HNSC患者的OS曲線。Kaplan-Meier曲線顯示了4種HNSC病理亞型中，上述前20個上調基因(E)和上述前20個下調基因(F)評分低或高的各亞型HNSC患者的OS曲線。
藍色線：低評分。紅線：高評分。HNSC：頭頸部鱗狀細胞癌。TPM：transcript per million。OS:總生存期。
研究小結：
本研究首次提供了OSCC中5mC和5hmC的全基因組、單堿基分辨率、平行圖譜。使用整合多組學方法，揭示了OSCC樣品中啟動子區(qū)域的5mC和5hmC單向修飾基因的表達變化上調。此外，具有啟動子5mC和5hmC單向修飾的此類差異調控基因可能與OSCC的臨床結局具有功能相關性。
參考文獻：
Zhao W, Zhu L, Gong Q, Ma S, Xiong H, Su T, Wan Z, Wang D. Unidirectional alteration of methylation and hydroxymethylation at the promoters and differential gene expression in oral squamous cell carcinoma. Front Genet. 2023;14:1269084. pii: 1269084. doi: 10.3389/fgene.2023.1269084. PubMed PMID: 37900177.
2023年10月12日，南華大學王丹玲教授和萬正卿為共同通訊作者在《Front Genet》雜志發(fā)表題為“Unidirectional alteration of methylation and hydroxymethylation at the promoters and differential gene expression in oral squamous cell carcinoma”的研究論文，該研究利用平行全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)和全基因組氧化亞硫酸氫測序(oxWGBS)，在成對原發(fā)口腔鱗狀細胞癌樣本及其正常癌旁組織(NATs)中以單核苷酸分辨率表征5mC和5hmC圖譜，并采用多組學方法分析5mC和5hmc修飾對OSCC差異基因表達的影響。
研究摘要：
本研究通過oxWGBS+WGBS在OSCC樣品中觀察到不同基因組區(qū)域的5mC和5hmC整體水平降低。在啟動子區(qū)域，OSCC中共鑒定出6921個差異甲基化區(qū)域和1024個差異羥甲基化區(qū)域。與5mC和5hmC共修飾相比，在啟動子區(qū)域5mC和5hmC單修飾與基因表達更大變化相關。此外，啟動子區(qū)域5mC和5hmC單修飾基因在細胞增殖、細胞分化和受體酪氨酸激酶通路等信號通路中富集，這些通路對腫瘤發(fā)生至關重要。最后，具有5mC和5hmC啟動子單修飾的前20個基因分組表達特征往往與某些亞型頭頸部鱗狀細胞癌的臨床結局相關。
研究結果表明使用平行WGBS和oxWGBS分析揭示了OSCC不同基因組區(qū)域的5mC和5hmC修飾整體減少。啟動子區(qū)域5mC和5hmC的單修飾與OSCC組織中基因表達的增強變化有關。此外這種在啟動子區(qū)域的5mC和5hmC單修飾差異表達基因可能與OSCC的臨床結局具有相關性。
結果圖形：
（1）5mC和5hmC在全基因組中的分布
表1：WGBS和oxWGBS文庫測序概況表2：WGBS和oxWGBS文庫中的亞硫酸鹽和氧化亞硫酸鹽轉化率表3：WGBS和oxWGBS文庫中不同胞嘧啶序列數(shù)量和平均甲基化率。圖1：OSCC和NAT樣本中DNA甲基化和羥甲基化圖譜
- PCA圖顯示OSCC組織和癌旁組織NAT的DNA甲基化模式的不同特征。每個點表示一個樣本。
- PCA圖顯示OSCC組織和NAT的DNA羥甲基化模式的不同特征。每個點表示一個樣本。
- 柱狀圖顯示不同樣本中甲基化或羥甲基化胞嘧啶比例。
- 5hmC修飾位點中5hmC百分比和5hmC修飾位點中5mC百分比。
- 小提琴圖顯示OSCC和NAT樣本的整體甲基化水平。
- 小提琴圖顯示OSCC和NAT樣本的整體羥甲基化水平。
（2）5mC和5hmC在基因組區(qū)域中的分布
圖2：5mC和5hmC在基因調控元件中的分布。
- CGI、CGI±2 kb區(qū)域和CGI±4 kb區(qū)域的平均甲基化率。
- CGI、CGI±2 kb區(qū)域和CGI±4 kb區(qū)域的平均羥甲基化率。
- Genebody、上下游±5 kb TSS的平均甲基化率。
- Genebody、上下游±5 kb TSS的平均羥甲基化率。
- 5'-UTR上游2 kb、5'-UTR、啟動子、基因體、外顯子、內含子、3'-UTR、3'-UTR下游2 kb區(qū)域的5mC平均甲基化率。
- 5'-UTR上游2 kb、5'-UTR、啟動子、基因體、外顯子、內含子、3'-UTR、3'-UTR下游2 kb的平均羥甲基化率。
（3）啟動子DMRs和DhMR鑒定
圖3：p-DMRs和p-DhMRs的鑒定- Circos圖顯示DMRs和DhMRs在所有染色體上的基因組分布。中間和內圈內的單獨條分別代表一個DMR或一個DhMR。每個條形圖的高度表示甲基化差異程度(Δβ值)，紅色條形圖表示高甲基化，藍色條形圖表示低甲基化。
- 條形圖顯示DMRs和DhMRs在每條染色體上的分布。y軸表示每M堿基對中的DMRs/DhMRs數(shù)。
- 條形圖顯示DMRs和DhMRs在每個基因組特征中的遺傳分布。y軸表示特定的基因組區(qū)域，x軸表示DMRs/DhMRs的富集比。
- 熱圖表示NAT和OSCC樣本中p-DMRs (β值的Z評分)水平，包括2390個高甲基化和4531個低甲基化p-DMRs。
- 熱圖表示NAT和腫瘤樣本中p-DhMRs (β值的Z評分)水平，其中278個高羥甲基化和746個低羥甲基化p-DhMRs
（4）甲基化、羥甲基化與基因表達的綜合分析
圖4：5mC、5hmC與基因表達的綜合分析
- 將5hmC在啟動子(標準色)或基因體(顏色較淺)區(qū)域的平均水平(黃色)、低水平(藍色)和高水平(紅色)的基因表達水平(每組的平均標準化計數(shù))分組。
- 高甲基化p-DMR(紅色)、低甲基化p-DMR(藍色)、高羥甲基化p-DhMR(淺紅色)、低羥甲基化p-DhMR(淺藍色)基因表達變化分組。
- 啟動子區(qū)5mc和5hmc變化不同組合對基因表達的分組變化。up-5mC5mc /up- 5hmc(紅色)，up- 5mc /down-5hmc(藍色)，down-5mc /up- 5hmc(淺紅色)，down- 5mc /down- 5hmc(淺藍色)。
- 點圖顯示啟動子區(qū)單down-5mC/down-5hmC的基因上調水平與down-5hmC水平的協(xié)調關系。
- 點圖顯示啟動子區(qū)單up-5mC/up-5hmC的基因下調水平與up-5hmC水平的協(xié)調關系。
- 條形圖顯示啟動子區(qū)5mC和5hmC單變化或共變化的基因功能簇。
（5）啟動子5mC和5hmC單修飾OSCC差異表達基因的功能分析
圖5：啟動子5mC和5hmC單向修飾基因與HNSC的臨床相關性
A-B. 方框圖顯示四種亞型的HNSC腫瘤和匹配的正常組織(TCGA“實體組織正常”樣本的HNSC患者)中，啟動子處down-5mC/down-5hmC的前20個上調基因(A)和啟動子處up-5mC/up-5hmC的前20個下調基因(B)的分組表達水平。分組表達水平定義為各組平均log2 (TPM + 1)。C–D. Kaplan-Meier曲線顯示了上述前20個上調基因標簽(C)和前20個下調基因標簽(D)
E-F. 低或高評分的HNSC患者的OS曲線。Kaplan-Meier曲線顯示了4種HNSC病理亞型中，上述前20個上調基因(E)和上述前20個下調基因(F)評分低或高的各亞型HNSC患者的OS曲線。
藍色線：低評分。紅線：高評分。HNSC：頭頸部鱗狀細胞癌。TPM：transcript per million。OS:總生存期。
研究小結：
本研究首次提供了OSCC中5mC和5hmC的全基因組、單堿基分辨率、平行圖譜。使用整合多組學方法，揭示了OSCC樣品中啟動子區(qū)域的5mC和5hmC單向修飾基因的表達變化上調。此外，具有啟動子5mC和5hmC單向修飾的此類差異調控基因可能與OSCC的臨床結局具有功能相關性。
參考文獻：
Zhao W, Zhu L, Gong Q, Ma S, Xiong H, Su T, Wan Z, Wang D. Unidirectional alteration of methylation and hydroxymethylation at the promoters and differential gene expression in oral squamous cell carcinoma. Front Genet. 2023;14:1269084. pii: 1269084. doi: 10.3389/fgene.2023.1269084. PubMed PMID: 37900177.
標簽：
DNA甲基化
