空間轉錄組DSP助力心臟結節(jié)病研究

文章題目：Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis

中文題目：心臟結節(jié)病的轉錄和免疫圖譜

見刊時間：2022.09

期刊名稱：Circulation Research

影響因子：20.1

實驗平臺：GeoMx DSP、snRNA-seq

DOI：10.1161/CIRCRESAHA.121.320449

 

研究背景

心臟受累是結節(jié)病患者死亡率的重要因素。盡管肉芽腫性炎癥是心臟結節(jié)病的一個標志，但構成肉芽腫精確的免疫細胞群仍不清楚。此外，尚不清楚心臟結節(jié)病與其他炎癥性心臟病相比的細胞和轉錄組學圖譜有何區(qū)別。

 

 研究方法 

研究者利用空間轉錄組（GeoMx DSP）和snRNA 測序來闡明心臟結節(jié)病的細胞和轉錄情況。使用DSP技術，研究者比較了人類心臟結節(jié)�。–S）、巨細胞心肌炎（GCM）和淋巴細胞性心肌炎中CD68+ 的免疫細胞的轉錄譜。研究者對人類心臟結節(jié)病進行了單核 RNA 測序，以鑒定免疫細胞類型和基因表達情況。使用多重免疫熒光染色，研究者驗證了通過snRNA 測序鑒定的免疫細胞群，確定了它們的空間關系，并設計了一種免疫染色方法來區(qū)分心臟結節(jié)病和其他炎癥性心臟病。 

 

 技術路線

 

 主要研究結果 

1. CS中骨髓細胞的轉錄組特征

研究者使用GeoMx DSP技術來檢測CD68+細胞，以了解CS、GCM 和淋巴細胞性心肌炎中骨髓細胞的轉錄差異。對于 CS 和 GCM 病例，選擇具有肉芽腫性炎癥的區(qū)域。對于淋巴細胞性心肌炎，選擇通過組織學和免疫熒光鑒定的具有密集淋巴組織細胞浸潤的區(qū)域。差異基因分析和KEGG富集分析顯示，在多個受試者和感興趣區(qū)域中都有轉錄變化�？傊�，與 GCM 和淋巴細胞性心肌炎相比，CS 中的骨髓細胞表現(xiàn)出獨特的轉錄組譜。

圖1 心臟結節(jié)病中骨髓細胞的轉錄組特征

2. CS 炎癥的細胞群和轉錄組特征

研究者對 4 個 CS 樣本分選的CD68+ 細胞進行了 snRNA-seq ，共聚類出12種細胞類型，其中主要炎癥細胞類型是骨髓細胞和 NK-T 細胞。對NK-T 細胞進行亞亞群分析，得到3 種細胞類型：NK 細胞、CD4+ T 細胞和 CD8+ T 細胞。人CS組織的免疫染色顯示，CD4+和CD8+T細胞主要位于肉芽腫的外圍。骨髓細胞亞亞群分析得到 6 個不同的骨髓細胞亞亞群，包括非經(jīng)典單核細胞、樹突狀細胞和4 組巨噬細胞（心臟駐留巨噬細胞和其它3個巨噬細胞群）。根據(jù) Palantir 偽時間軌跡分析顯示，這 6 個骨髓亞亞群表現(xiàn)出不同的細胞分化潛力，其中 Mac_res 和 Mac_GPNMB 群分化程度最高。

研究者之后使用多色免疫熒光揭示了 CS 中骨髓細胞類型的空間分布。Mac_GPNMB 亞簇代表多核巨細胞。數(shù)據(jù)也凸顯了 CS 中骨髓細胞群復雜的異質性和空間分布。GPNMB染色存在于多核巨細胞中，表明Mac_GPNMB亞簇代表多核巨細胞。研究者將 GPNMB 鑒定為 CS 中多核巨細胞的分子標記。

圖2 心臟結節(jié)病的細胞群和轉錄組特征

 

3. CS 中雷帕霉素途徑激活和巨噬細胞增殖活化

為了進一步了解骨髓細胞在 CS 中的作用，研究者將 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A與 Mac_res的轉錄表達進行了比較。研究者鑒定了 621 個上調(diào)的差異表達基因，這些基因與多種免疫調(diào)節(jié)途徑相關，包括 mTOR（雷帕霉素的哺乳動物靶標）信號傳導。p-S6（磷酸化 S6 核糖體蛋白）是 mTOR 通路激活的標志物。免疫染色顯示 14 個 CS 樣本的肉芽腫中 p-S6 表達水平存在差異。通過 Ki67 染色評估，肉芽腫中 p-S6 染色的程度與細胞增殖相關。這些結果表明心臟結節(jié)肉芽腫由多種骨髓細胞類型組成。此外，研究者提出了mTOR激活可能調(diào)節(jié)特定巨噬細胞亞群(包括Mac_HLA-DR和Mac_SYTL3亞群)擴張的可能性。

 

圖3 心臟結節(jié)病中的 mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶點）通路激活和巨噬細胞增殖

 

4. 多核巨細胞顯示出特定的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡

為了了解 Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3、Mac_GPNMB、DC_CD1C 和 mono_ FCGR3A 到 Mac_res 簇的功能，研究者進行了KEGG分析。Mac_GPNMB 簇（多核巨細胞）顯示出溶酶體和 PPAR 途徑的顯著富集。其他亞簇顯示出一些重疊的特征。

研究者進一步對骨髓細胞群進行了基因調(diào)控網(wǎng)絡分析。Mac_GPNMB（多核巨細胞）中富集了多種調(diào)節(jié)子及其轉錄因子，包括 MITF（小眼相關轉錄因子）、TFEC（轉錄因子 EC）、ARID5B（富含 AT 的相互作用結構域蛋白 5B）和 NR1H3（肝臟X受體α）。TF調(diào)控網(wǎng)絡分析預測了Mac_GPNMB亞簇中這些TF調(diào)控的幾個下游基因。研究者也驗證了MITF轉錄在Mac_GPNMB中的作用。

接下來，研究者研究了巨細胞（Mac_GPNMB）、單核細胞（Mono_ FCGR3A）、其他巨噬細胞（Mac_res、Mac_HLA-DR、Mac_SYTL3）、樹突狀細胞（DC_CD1C）、T細胞（T_CD4、T_CD8）和NK細胞之間可能的細胞間通訊。該分析預測了多核巨細胞和其他骨髓細胞之間的細胞間相互作用。研究者用擬時序分析探討了了多核巨細胞的起源。結果表明，CS（Mac_GPNMB）中的多核巨細胞處于相對分化的狀態(tài)。

 

圖4 多核巨細胞顯示出特定的轉錄調(diào)控網(wǎng)絡

 

5. Mac_GPNMB是CS組中特殊存在的細胞亞群

為了證明 Mac_ GPNMB 亞群（多核巨細胞群）在 CS 中特異性存在或富集，研究者比較了來自非患病人類心臟（供體心臟）、人ICM 和人NICM 的 snRNA-seq 數(shù)據(jù)。研究者觀察到跨數(shù)據(jù)集的 Mac_res 細胞之間存在很強的對應性，但 Mac_GPNMB、Mac_HLA-DR 和 Mac_SYTL3 的轉錄特征在 ICM、NICM 和供體骨髓細胞中表達較弱。此外，與 CS 相比，GPNMB 表達在 ICM、NICM 和供體骨髓細胞中表達較弱，并且不集中在 Mac_GPNMB 簇中。這些數(shù)據(jù)支持Mac_GPNMB集群特定在CS組中存在。

研究者確定了 CS 肉芽腫的特定染色模式：GPNMB+ 多核巨細胞被HLA-DR 陽性上皮樣組織細胞包圍。接下來，研究者探討了這些特征在區(qū)分各種心臟病方面的臨床效用。因此， CS 中 GPNMB+  和 HLA-DR+  巨噬細胞的獨特組織特征，可能為區(qū)分 CS 與其他形式的心肌炎（包括 GCM）提供診斷實用性。

 

圖5 將骨髓亞亞群映射到數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)中

 

圖6 GPNMB（跨膜糖蛋白 NMB）和 HLA-DR（人類白細胞抗原-DR 同種型）免疫染色可區(qū)分心臟結節(jié)病和其他形式的心肌炎

 

 研究意義 

研究者通過剖析 CS 的細胞群和轉錄特征，闡明了肉芽腫性炎癥區(qū)域內(nèi)存在多種不同的單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞群。CS 中的多核巨細胞表達 GPNMB，并被由 HLA-DR+ 和 SYTL3+ 巨噬細胞組成的上皮樣組織細胞包圍，顯示出強大的 mTOR 激活。在診斷上，研究者發(fā)現(xiàn) GPMNB 和 HLA-DR 染色可能提供一種區(qū)分 CS 與其他炎癥性心肌病的方法。

 

參考文獻：

Liu J, Ma P, Lai L, Villanueva A, Koenig A, Bean GR, Bowles DE, Glass C, Watson M, Lavine KJ, Lin CY. Transcriptional and Immune Landscape of Cardiac Sarcoidosis. Circ Res. 2022 Sep 30;131(8):654-669. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.121.320449. Epub 2022 Sep 16. PMID: 36111531; PMCID: PMC9514756.