染色質(zhì)重塑/組蛋白修飾/DNA甲基化應(yīng)用:人早期胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控
哺乳動(dòng)物發(fā)育研究促進(jìn)了對(duì)協(xié)調(diào)胚胎發(fā)生遺傳、表觀遺傳和細(xì)胞過程的理解，并揭示了對(duì)人類胚胎發(fā)生特異性新見解。最近研究生成了人類早期胚胎發(fā)生的第一個(gè)表觀遺傳學(xué)圖譜，激發(fā)了關(guān)于表觀遺傳學(xué)重編程、細(xì)胞命運(yùn)調(diào)控以及支撐人類胚胎發(fā)育可塑性的潛在機(jī)制新想法。本綜述討論了這些對(duì)人類早期發(fā)育的表觀遺傳學(xué)調(diào)控新見解以及這些過程對(duì)保護(hù)發(fā)育的重要性，還強(qiáng)調(diào)了尚未解決的問題和尚待解決的關(guān)鍵挑戰(zhàn)。
背景（Introduction）
表觀基因組在胚胎發(fā)育的最初幾天會(huì)發(fā)生巨大變化。表觀基因組重置和建立在胚胎發(fā)生的更廣泛過程中進(jìn)行協(xié)調(diào)和促進(jìn)。因此需要表觀遺傳調(diào)控來保護(hù)發(fā)育并建立在整個(gè)生命過程中對(duì)基因組功能有影響的長期表觀遺傳狀態(tài)。
表觀遺傳信息通過告訴細(xì)胞它們的過去、現(xiàn)在和未來來促進(jìn)胚胎發(fā)育。它提供了對(duì)所做決定和過去遇到情況的分子記憶，將早期事件作為化學(xué)標(biāo)記整合到基因組中并穩(wěn)定傳遞。這些標(biāo)記也會(huì)預(yù)示未來事件，尤其是譜系分化決定，并由不同的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的調(diào)控下發(fā)揮廣泛作用，這些調(diào)節(jié)因子本身具有不同的功能并劃分不同的基因組元件。多種表觀遺傳通路（包括染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和DNA甲基化）的協(xié)調(diào)調(diào)控著基因時(shí)空表達(dá)，并嚴(yán)格限制胚胎發(fā)生過程中重復(fù)元件的必要但潛在有害的活動(dòng)。
受精后，高度特化的精子和卵母細(xì)胞的表觀基因組被重編程，以建立適合胚胎發(fā)育的全能性狀態(tài)。母系遺傳因素在受精后的前3天維持人類胚胎的分裂，然后在4細(xì)胞期(4C)到8細(xì)胞(8C)期發(fā)生胚胎基因組激活(embryonic genome activation，EGA)的主要波。經(jīng)過EGA后，人類胚胎首先形成桑葚胚，然后形成具有明確內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的早期囊胚，植入囊胚有三種不同的細(xì)胞系：上胚層(epiblast，產(chǎn)生所有胎兒組織)、下胚層(hypoblast，形成卵黃囊)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，后來形成胎盤)。在接下來的一周內(nèi)，胚胎形成額外的胚胎外譜系，外胚層開始按照原腸胚形成的預(yù)期進(jìn)行定型，這在胚胎發(fā)生的第三周開始。
關(guān)于人類胚胎發(fā)生的許多知識(shí)來自于對(duì)組織學(xué)的集合研究。最近改進(jìn)的方法使人類胚胎的體外培養(yǎng)和研究成為可能，直到大約胚胎第14天(E)。與此同時(shí)，由于人類胚胎研究存在重大技術(shù)和倫理挑戰(zhàn)，大量的體外系統(tǒng)旨在復(fù)制全部或部分早期人類胚胎。這些細(xì)胞包括反映原腸胚形成前期的細(xì)胞，包括8c樣細(xì)胞(8clc)、初始和啟動(dòng)的人多能干細(xì)胞(hPSCs)和譜系限制性細(xì)胞系。其中一些細(xì)胞類型還提供了構(gòu)建更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，如基于干細(xì)胞的整合模型(囊胚和植入后組裝體)和非整合模型，如原腸樣細(xì)胞。
本綜述討論了早期人類發(fā)育的表觀遺傳表征的新見解。這些研究對(duì)于理解表觀遺傳過程如何幫助調(diào)控和協(xié)調(diào)人類胚胎發(fā)生，以及表觀遺傳過程如何在這一時(shí)期與其他細(xì)胞和分子通路協(xié)調(diào)發(fā)生具有重要意義。對(duì)表觀遺傳過程的深入了解也將揭示表觀基因組對(duì)遺傳和環(huán)境變異的脆弱性。盡管重點(diǎn)是人類胚胎發(fā)育，但在相關(guān)條件下與其他物種的新數(shù)據(jù)以及基于干細(xì)胞的胚胎模型進(jìn)行了比較。這些替代系統(tǒng)對(duì)于幫助建立發(fā)育過程中表觀遺傳過程的因果關(guān)系至關(guān)重要。此外還概述了當(dāng)前的知識(shí)差距和關(guān)鍵的未決問題。
染色質(zhì)重塑：打開胚胎基因組以塑造發(fā)育程序
在人類胚胎發(fā)生期間，染色質(zhì)廣泛重塑以改變其可及性，最大變化與關(guān)鍵發(fā)育的重要階段重合(圖1)。染色質(zhì)可及性可定義為DNA可用于因子(包括轉(zhuǎn)錄機(jī)制和表觀遺傳修飾因子)結(jié)合的程度，其中主要決定因素包括核小體密度和間距。這樣，染色質(zhì)可及性代表了區(qū)域調(diào)控基因表達(dá)的潛力。
圖1：人類胚胎發(fā)育中的整體表觀基因組變化
染色質(zhì)可及性(可及區(qū)域的數(shù)量)、組蛋白修飾和DNA甲基化的整體水平(黑色實(shí)線)的相對(duì)變化，以及TAD信號(hào)的相對(duì)變化。粉色和藍(lán)色虛線分別表示母本和父本基因組之間的差異�；疑幱氨硎咀儺愋�。橙色虛線表示食蟹猴胚胎的動(dòng)態(tài)變化。Ecto，外胚層（ectoderm）；Endo，內(nèi)胚層（endoderm）; Meso,中胚層（mesoderm）；PS，原始條紋（primitive streak）。
酶的DNA可及性是用于定量染色質(zhì)可及性的技術(shù)基礎(chǔ)。這些酶既可以切割可及DNA (DNase-seq和ATAC-seq)，也可以甲基化可及胞嘧啶(NOMe-seq)，這兩種酶都可以通過高通量測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。將這些方法應(yīng)用于微量（low-input）和單細(xì)胞（single-cell）應(yīng)用，能夠?qū)θ祟惻咛サ娜旧|(zhì)可及性進(jìn)行分析。
這些研究的一致發(fā)現(xiàn)是，在2-細(xì)胞(2C)和囊胚期之間，人類胚胎基因組中已鑒定的可接近區(qū)域的數(shù)量逐漸增加(圖1)。不同研究中增加的程度有很大差異，可能是由于用于鑒定可接近染色質(zhì)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法不同。但總體趨勢(shì)一致。與可接近區(qū)域的數(shù)量相反，在增加到囊胚期之前，從受精卵到8C期的總?cè)旧|(zhì)可及性(通過基于甲基化的基因組中可及胞嘧啶比例定量確定)短暫降低。這一模式可能表明人類受精卵具有全基因組開放的染色質(zhì)狀態(tài)，這是切割方法無法檢測(cè)到的�？傊�，這些染色質(zhì)可及性的動(dòng)態(tài)變化支持基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRNs)在早期發(fā)育過程中多次重塑，以建立新的發(fā)育程序。
受精卵的初始重塑定義pre-EGA染色質(zhì)可及性
在整個(gè)人類胚胎發(fā)育過程中，可及性區(qū)域富集了啟動(dòng)子、CpG島和遠(yuǎn)端調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)，與卵母細(xì)胞相比，超過8000個(gè)啟動(dòng)子在人類受精卵中獲得可及性，這些啟動(dòng)子通常在植入前發(fā)育的整個(gè)過程中保持開放狀態(tài)。
鑒于胚胎基因組的主要轉(zhuǎn)錄直到EGA才發(fā)生，那么在8C期之前大量可及性染色質(zhì)區(qū)域的功能是什么?一種可能性是這些染色質(zhì)變化是親本基因組從配子狀態(tài)重塑到胚胎狀態(tài)的副作用。卵母細(xì)胞的染色質(zhì)相對(duì)開放，而精子的染色質(zhì)高度濃縮在人類胚胎中，受精后父源基因組的可及性迅速增加，達(dá)到高于母源基因組的水平。這種不對(duì)稱差異一直維持至4C期，此時(shí)母本和父本基因組的可及性在EGA中相等。
另一種可能性是在受精卵中獲得可及性區(qū)域支持次要EGA，即少量基因在主要pre-EGA轉(zhuǎn)錄。然而這并不能完全解釋在pre-EGA胚胎中存在數(shù)千個(gè)可及區(qū)域。第三種情況與發(fā)育基因調(diào)控相關(guān)。人類2C胚胎中的大多數(shù)可及啟動(dòng)子也在8C期獲得，盡管這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄不在2C期發(fā)生，但其中許多基因后來在8C期表達(dá) (圖2A)。因此，這些可接近啟動(dòng)子可能在2C期“蓄勢(shì)”以備以后的激活，這意味著pre-EGA染色質(zhì)譜的建立可能對(duì)EGA主要基因子集的及時(shí)表達(dá)非常重要。這種pre-EGA啟動(dòng)子形式已經(jīng)在斑馬魚中報(bào)道過，在人類胚胎中，在pre-EGA獲得可及性區(qū)域在代謝和生物合成等功能上富集。單細(xì)胞方法表明，相同胚胎期的單個(gè)細(xì)胞之間總是可接近這些區(qū)域 (圖2B)。與在早期發(fā)育后期獲得可及性或以更異質(zhì)性方式獲得可及性的基因相比，這種早期可及性獲得同質(zhì)模式的基因在EGA后表達(dá)更高。因此，pre-EGA染色質(zhì)可及性景觀也可能為重要的管家（housekeeping）基因提供高水平表達(dá)的基礎(chǔ)，從而為發(fā)育過程的發(fā)生提供基礎(chǔ)。
圖2：人類植入前胚胎發(fā)育中染色質(zhì)可及性和組蛋白修飾的區(qū)域特異性動(dòng)態(tài)變化
EGA的主要染色質(zhì)可及性重塑
早期人類胚胎中染色質(zhì)可及性的最大差異，特別是在啟動(dòng)子上，區(qū)分了4C和早期與8C和后期。這個(gè)分離點(diǎn)與EGA一致，事實(shí)上，大多數(shù)在EGA轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因在4C和8C期之間變得可接近。
這種染色質(zhì)譜的重塑在EGA中是否具有功能作用？單細(xì)胞中染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析顯示，從2C到桑椹胚期的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)反映在其啟動(dòng)子和假定的遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)的可及性動(dòng)態(tài)。這些關(guān)系的因果關(guān)系尚不清楚。許多啟動(dòng)子在EGA處表現(xiàn)出其可及性區(qū)域擴(kuò)大，這與轉(zhuǎn)錄增加一致。然而在經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑α-amanitin處理的胚胎中，大多數(shù)啟動(dòng)子的可及性區(qū)域都會(huì)擴(kuò)大。這表明，至少對(duì)于啟動(dòng)子來說，可及性增加主要先于基因表達(dá)增加。相反，可接近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄非依賴性擴(kuò)大可以通過重新定位核小體的整體過程來介導(dǎo)。相反，α-amanitin處理也導(dǎo)致8C胚胎具有類似于Pre-EGA胚胎的遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)元件可及性。這表明轉(zhuǎn)錄對(duì)于EGA染色質(zhì)可及性的改變是必要的，至少在遠(yuǎn)端元件是如此�？傊�，調(diào)控區(qū)域染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)相關(guān)；然而染色質(zhì)可及性變化可能在不同的調(diào)控區(qū)環(huán)境中驅(qū)動(dòng)或反映EGA結(jié)果。
染色質(zhì)可及性變化與譜系特異性有關(guān)
從人類發(fā)育的桑葚胚期及其以后在其啟動(dòng)子處獲得可及性的基因在發(fā)育過程中富集。這一可及性的增加先于第一次譜系決定，表明染色質(zhì)可及性可能在細(xì)胞譜系分離過程中對(duì)GRN形成具有重要的功能。僅從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)就可以推斷出GRN。然而，在GRN分析中納入染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)可提高準(zhǔn)確性，特別是對(duì)于人類胚胎數(shù)據(jù)等低樣本量的數(shù)據(jù)，并且可以預(yù)測(cè)增強(qiáng)子相關(guān)性。這些方法在人類囊胚譜系中鑒定出保守的GRN，由JUND和SOX4組成，它們共同調(diào)節(jié)TFAP2C表達(dá)，而TFAP2C又調(diào)控GCM1表達(dá)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)可及性圖譜對(duì)于理解GRN在早期胚胎發(fā)育過程中如何變化的價(jià)值。
可能影響細(xì)胞命運(yùn)決定的另一個(gè)重要特征是，染色質(zhì)可及性(尤其是啟動(dòng)子)的細(xì)胞間變化從桑葚胚期開始顯著增加(圖1)。啟動(dòng)子可及性與這些區(qū)域的基因表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)，這意味著啟動(dòng)子可及性變化可能驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)變化(圖2B)。同時(shí)，ICM調(diào)節(jié)因子(OCT4、KLF和SOX家族)和滋養(yǎng)細(xì)胞外胚層調(diào)節(jié)因子(GATA和TEAD家族)的motif區(qū)域富集。因此，胚胎內(nèi)染色質(zhì)可及性異質(zhì)性可能提供了細(xì)胞命運(yùn)決定的靈活性，或使細(xì)胞偏向于特定命運(yùn)。
盡管人類胚胎中介導(dǎo)與譜系分離和變化相關(guān)的染色質(zhì)可及性變化因子尚未鑒定，但有幾個(gè)很有前景的線索。這包括早期小鼠胚胎發(fā)育所需的核小體重塑復(fù)合物(SWI/SNF、CHD和ISWI) ，以及與初始hPSCs中的外胚層轉(zhuǎn)錄因子OCT4相關(guān)的核小體重塑SNF2家族亞基，以調(diào)節(jié)囊胚譜系基因。此外雖然在人類植入前發(fā)育的所有階段，可及性和DNA甲基化之間呈負(fù)相關(guān)，但在同一胚胎期細(xì)胞中，染色質(zhì)可及性最可變區(qū)域是最一致的低甲基化區(qū)域。這表明低甲基化可能支持染色質(zhì)可及性變化。這可能通過允許甲基化微小變化驅(qū)動(dòng)核小體占位實(shí)質(zhì)性變化，從而實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)可及性�；蛘叩图谆赡軜�(gòu)成一種允許其他因子(包括轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合的狀態(tài)，而轉(zhuǎn)錄因子又根據(jù)可變的可利用性影響染色質(zhì)可及性。通過這種方式，染色質(zhì)重塑和DNA甲基化互作可能有助于人類早期發(fā)育的細(xì)胞可塑性。
對(duì)于大多數(shù)啟動(dòng)子，post-EGA期可及性增加與該階段各自基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。然而其他基因顯示出更復(fù)雜的關(guān)系，可能意味著調(diào)控發(fā)育基因的不同機(jī)制。高達(dá)30%啟動(dòng)子在8C或桑椹胚期可及，但在post-EGA植入前期沒有表達(dá)。這些啟動(dòng)子可以在植入后期被激活。雖然這種可能性需要進(jìn)一步研究，但一項(xiàng)相關(guān)發(fā)現(xiàn)是8CLC可及區(qū)域富集通常與原腸胚形成后譜系相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子motif。這些可及基因可能在早期表達(dá)，但在被其他過程沉默時(shí)保持其可及性。一個(gè)例子是EGA基因在桑葚胚期被沉默。
人類胚胎植入后的染色質(zhì)可及性還有待研究。因此染色質(zhì)可及性譜如何在植入后譜系中解決仍然未知。然而染色質(zhì)可及性已在食蟹猴胚胎植入后發(fā)育中進(jìn)行了研究。該研究結(jié)果表明，染色質(zhì)可及性在原始條索狀細(xì)胞中達(dá)到峰值，之后在分化較強(qiáng)的胚層譜系中下降(圖1)。這在人類胚胎中是否保守具有重要意義。為此研究者在基于干細(xì)胞植入后人類發(fā)育模型中共同研究了染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，以研究這一人類模型對(duì)靈長類胚胎是否顯示出類似的染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)變化，以及植入后的譜系命運(yùn)是否可能在發(fā)育早期就已確定。
總之染色質(zhì)重塑改變了早期人類胚胎發(fā)育的多個(gè)時(shí)期可及性圖譜，并涉及從胚胎轉(zhuǎn)錄激活到未來基因表達(dá)鑒定等廣泛過程。關(guān)鍵問題包括：啟動(dòng)子狀態(tài)是否持續(xù)至植入后階段？染色質(zhì)可及性變化是否指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定，這種變化的誘導(dǎo)因子？人類胚胎發(fā)育背景下可及性區(qū)域廣度如何影響區(qū)域調(diào)控潛力？轉(zhuǎn)錄因子、核小體重塑因子和轉(zhuǎn)錄本身可能部分導(dǎo)致染色質(zhì)可及性變化。然而染色質(zhì)重塑發(fā)生在更廣泛的表觀遺傳重編程背景下，因此DNA甲基化和組蛋白修飾變化也可能有助于染色質(zhì)重塑的最終功能結(jié)局。
組蛋白修飾：基因組激活和發(fā)育基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控因子
與染色質(zhì)可及性相似，組蛋白修飾在發(fā)育過程中也高度動(dòng)態(tài)(圖1)。組蛋白修飾變化普遍存在，發(fā)生在不同的發(fā)育時(shí)期和不同類型的基因組區(qū)域之間。組蛋白修飾具有組合作用，大致可分為兩類：(1)促進(jìn)性染色質(zhì)相關(guān)修飾，如啟動(dòng)子上的H3K4me3，增強(qiáng)子和其他基因間區(qū)域的H3K4me1，以及活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子上的H3K27ac；(2)抑制性染色質(zhì)相關(guān)修飾，如H3K27me3和H3K9me3。每一種修飾又會(huì)招募下游效應(yīng)因子，進(jìn)而介導(dǎo)對(duì)基因組功能和活性的進(jìn)一步影響�？梢宰R(shí)別或調(diào)節(jié)組蛋白的系統(tǒng)具有多種亞基、亞型和變異體，其復(fù)雜性非常巨大，而且還在不斷擴(kuò)大。
發(fā)育過程中組蛋白修飾圖譜繪制落后于其他表觀遺傳標(biāo)記，主要是因?yàn)榻M蛋白分析方法通常需要數(shù)千~數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞，因此與可用胚胎細(xì)胞數(shù)量匹配。同時(shí)也已經(jīng)開發(fā)出需要更少樣本的方法，例如low-input染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）、CUT&RUN和CUT&Tag，并已被用于生成第一個(gè)人類胚胎和其他物種的組蛋白修飾圖。
卵母細(xì)胞和早期胚胎中的經(jīng)典和非經(jīng)典組蛋白修飾模式
在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎生長過程中，組蛋白標(biāo)記沉積在時(shí)間和空間上受到高度調(diào)節(jié)。人類和其他哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞含有較大的非轉(zhuǎn)錄部分DNA甲基化結(jié)構(gòu)域（PMDs）。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中，卵母細(xì)胞中的PMD由H3K4me3標(biāo)記。但在人類卵母細(xì)胞中，PMDs沒有被H3K4me3標(biāo)記，相反卵母細(xì)胞在基因啟動(dòng)子處具有H3K4me3強(qiáng)富集的狹窄區(qū)域的典型模式，精子中也存在類似的模式（圖2A）。受精后，2C和4C人類胚胎在卵母細(xì)胞遺傳的PMD中獲得中等水平的H3K4me3。這樣pre-EGA人類胚胎獲得了在這個(gè)發(fā)育期與小鼠胚胎更相似的一種整體H3K4me3模式。然而與小鼠相比，人類卵母細(xì)胞PMDs中H3K4me3增加是有限，因?yàn)檫@些區(qū)域的H3K4me3水平相對(duì)于啟動(dòng)子中的H3K4me3水平較低，并且也僅限于富集基因的卵母細(xì)胞的PMD子集。此外一些啟動(dòng)子獲得H3K4me3，與轉(zhuǎn)錄無關(guān)，但似乎反映了活性甲基轉(zhuǎn)移酶的靶向性，特別是對(duì)未甲基化的CpG富集區(qū)域。在小鼠中，H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2B在啟動(dòng)子和PMD上以不依賴轉(zhuǎn)錄的方式催化H3K4me3，并可能在pre-EGA人類胚胎發(fā)揮類似作用。
其他組蛋白修飾的式在物種間更為保守。在人類和其他物種的卵母細(xì)胞中，PMD具有廣泛的H3K27me3覆蓋率。雖然這種覆蓋率功能尚不確定，但小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎中較大的基因間H3K27me3修飾區(qū)域形成了自我互作結(jié)構(gòu)域，據(jù)推測(cè)這些結(jié)構(gòu)域可以劃分母本基因組以誘導(dǎo)抑制重復(fù)元件。H3K27me3也存在于人類卵母細(xì)胞、精子和早期胚胎中，位于與發(fā)育基因啟動(dòng)子重疊的強(qiáng)富集典型位點(diǎn)。H3K9me3相對(duì)于其他胚胎期，在人類卵母細(xì)胞的基因密集區(qū)域富集，這可能提供了抑制卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的另一種機(jī)制。
到2C期，大多數(shù)精子遺傳的H3K27me3丟失，而卵母細(xì)胞特異性H3K27me3被短暫保留，然后在4C期去除。這些動(dòng)態(tài)變化與受精后的牛和豬胚胎相似，但與小鼠胚胎不同，小鼠胚胎在囊胚期前保留了一些卵母細(xì)胞遺傳的H3K27me3。這些差異對(duì)小鼠依賴卵母細(xì)胞來源的H3K27me3維持過程具有重要意義。與受精后PMD中H3K27me3去除相一致，這些廣泛區(qū)域中的大多數(shù)基因在2C和4C胚胎中被H3K27ac標(biāo)記，與H3K4me3重疊。鑒于這些結(jié)構(gòu)域在卵母細(xì)胞中被H3K27me3修飾，H3K27ac很可能在受精后的PMDs中de novo 建立。需要在人卵母細(xì)胞對(duì)H3K27ac進(jìn)行分析來證實(shí)這一假設(shè)。
特別重要的是這些表觀基因組變化是否調(diào)控EGA基因激活。可能調(diào)節(jié)EGA基因的增強(qiáng)子序列經(jīng)歷重編程，從而導(dǎo)致H3K9me3丟失，并在4C期和8C期之間更易接近性，這與EGA基因被激活時(shí)間相對(duì)應(yīng)。通過表達(dá)dCas9-KRAB誘導(dǎo)H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶的位點(diǎn)特異性募集，從而在人類胚胎中實(shí)驗(yàn)性強(qiáng)制H3K9me3的持久性，導(dǎo)致EGA基因不能完全激活和發(fā)育遲緩。這些實(shí)驗(yàn)表明EGA基因調(diào)控區(qū)域需要重塑，以調(diào)控其在發(fā)育過程中的激活時(shí)間。另一種可能性是4C胚胎中廣泛的H3K4me3結(jié)構(gòu)域有助于瞬時(shí)抑制EGA直到合適時(shí)間。這一觀點(diǎn)在小鼠和豬受精卵中H3K4me3去甲基化酶敲除的研究中得到支持，這導(dǎo)致EGA基因激活減少且未能發(fā)育到囊胚期。這表明及時(shí)解決這些大結(jié)構(gòu)域是必需步驟。成功EGA可能需要將H3K27ac的廣泛結(jié)構(gòu)域分解成narrow peaks，因?yàn)槿祟愂芫阎薪M蛋白去乙�；甘Щ钕拗艵GA基因子集轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)�？傊�，EGA前調(diào)控去除特定組蛋白修飾是確保發(fā)育進(jìn)展的主要表觀遺傳事件。
Post-EGA表觀遺傳重構(gòu)建立新的發(fā)育程序
從8C期到囊胚期人類胚胎發(fā)育涵蓋了廣泛的組蛋白修飾變化（圖2A）。這一時(shí)期的一個(gè)顯著特征是8C人類胚胎中幾乎不存在H3K27me3。這可能是由于缺乏母體提供的催化H3K27me3的polycomb蛋白，以及受精后不久H3K27me3（尤其是精子來源的H3K27me3）主動(dòng)清除。在EGA之前，啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的去除在物種間高度保守。
8 C期EGA顯著改變了表觀遺傳修飾因子豐度，每個(gè)修飾因子都有其對(duì)經(jīng)典或非經(jīng)典靶點(diǎn)偏好。因此，EGA（母系遺傳）前與EGA（基因組轉(zhuǎn)錄）后表觀遺傳修飾因子可用性差異重塑表觀基因組。例如，Polycomb組蛋白在EGA之后轉(zhuǎn)錄，并在發(fā)育基因附近沉積H3K27me3，在此過程中將大多數(shù)CpG富集調(diào)節(jié)區(qū)域分解為活性、二價(jià)或抑制染色質(zhì)狀態(tài)（圖2A）。確認(rèn)共修飾的二價(jià)核小體（H3K27me3和H3K4me3）需要進(jìn)一步分析，如單核小體分析或ChIP分析。H3K27me3的另一個(gè)潛在功能是在EGA完成后幫助抑制啟動(dòng)EGA基因。在囊胚中，H3K27me3存在于EGA基因啟動(dòng)子處，表明其可能在影響EGA退出中發(fā)揮作用。已在牛胚胎中使用α-amanitin蛋白阻斷胚胎基因組轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)polycomb組蛋白表達(dá)。處理后胚胎的染色質(zhì)狀態(tài)保持在pre-EGA模式，表明轉(zhuǎn)錄和激活polycomb組蛋白表達(dá)是重組EGA后表觀遺傳圖譜所必需。H3K4me3水平在4C和8C期間也發(fā)生顯著變化，這與卵母細(xì)胞遺傳的PMDs中H3K4me3減少和許多基因啟動(dòng)子中H3K4me3減少有關(guān)。這些變化伴隨著H3K4去甲基化酶KDM5B的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)和H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2B的下調(diào)，盡管這些蛋白在人類胚胎中的功能作用尚未驗(yàn)證。
一個(gè)關(guān)鍵的問題是為什么胚胎在早期胚胎發(fā)生中經(jīng)歷組蛋白標(biāo)記重編程。有幾個(gè)潛在的原因：解決預(yù)先存在的染色質(zhì)狀態(tài)，去除親本遺傳的表觀遺傳標(biāo)記和表觀突變（epimutations），或支持發(fā)病和關(guān)閉EGA。無論是什么原因，一旦重置，新的染色質(zhì)狀態(tài)將繼續(xù)建立，由CpG序列存在、染色質(zhì)蛋白可用性以及與其他基因調(diào)控過程互作，從而導(dǎo)致順式調(diào)控區(qū)域的重新標(biāo)記和發(fā)育程序出現(xiàn)。
組蛋白修飾對(duì)胚胎譜系分化的影響
組蛋白修飾是否以及如何影響植入前人類胚胎的譜系命運(yùn)是重要的，尚未解決的問題。一些外胚層特異性和內(nèi)胚層特異性基因在滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中被H3K27me3標(biāo)記，盡管大多數(shù)滋養(yǎng)外胚層特異性基因在早期胚泡的ICM細(xì)胞中基本上沒有H3K27me3。這些不對(duì)稱模式可能會(huì)隨著胚胎的發(fā)育而加強(qiáng)譜系決定。在牛胚泡中也觀察到了某些譜系調(diào)節(jié)因子的交叉抑制模。事實(shí)上，干擾H3K27me3在人胚泡細(xì)胞和初始hPSC中的沉積會(huì)導(dǎo)致從外胚層樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)外胚層樣狀態(tài)。
同樣的，可以拮抗某些轉(zhuǎn)錄因子與其靶序列結(jié)合的H3K9me3也可能有助于形成新的GRN。H3K9me3沉積中的細(xì)胞特異性差異可能通過限制早期滋養(yǎng)外胚層中的特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和激活可能促進(jìn)ICM命運(yùn)的基因來加強(qiáng)譜系障礙。為了進(jìn)一步定義GRN，繪制H3K27ac和染色質(zhì)可及性已經(jīng)確定了8C和ICM細(xì)胞中假定的活性增強(qiáng)子（圖2A）。在這些增強(qiáng)子上富集的DNA序列包括那些與譜系限制性轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)motif匹配的序列。
總之，在早期人類胚胎發(fā)育過程中，組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生重大變化，且在EGA因子和發(fā)育基因調(diào)控的特定基因組表征上發(fā)生變化。關(guān)鍵的未解決問題包括：組蛋白修飾是否調(diào)控EGA基因的及時(shí)誘導(dǎo)和隨后的抑制？染色質(zhì)修飾過程在賦予早期胚胎細(xì)胞與多譜系分化的持續(xù)能力相關(guān)的發(fā)育可塑性方面的確切作用是什么？在更多的胚胎期（包括植入后）對(duì)組蛋白修飾進(jìn)行進(jìn)一步分析，以及有針對(duì)性的表觀基因組工程和功能喪失方法，以檢測(cè)定義因子在胚胎和胚胎模型中的致病作用，將有助于克服其中一些知識(shí)空白。更廣泛地說，在其他情況下的研究已經(jīng)證實(shí)，染色質(zhì)的組蛋白狀態(tài)也決定了其他基本的細(xì)胞過程，包括DNA復(fù)制和DNA修復(fù)。更好地了解組蛋白修飾與早期人類胚胎發(fā)生中DNA復(fù)制/修復(fù)之間的關(guān)系是一個(gè)很有前景的研究方向。鑒于人類胚胎中非整倍體細(xì)胞的高發(fā)生率，這一點(diǎn)尤其重要。
DNA甲基化：保護(hù)基因組穩(wěn)定性和發(fā)育基因表達(dá)
DNA甲基化是指在胞嘧啶中添加甲基以形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC），其主要發(fā)生在CpG二核苷酸上。DNA甲基化模式由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B建立，并由DNMT1維持，非催化蛋白DNMT3L作為輔因子，在它們?nèi)笔У那闆r下，5mC通過被動(dòng)去甲基化或通過TET羥化酶將5mC氧化成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)的主動(dòng)DNA去甲基化從基因組中去除。檢測(cè)胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化的主要方法是用識(shí)別5mC的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和分析技術(shù)，包括簡化基因組甲基化測(cè)序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)，全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）和PBAT甲基化測(cè)序（post-bisulfite adapter tagging）。
胚胎植入前發(fā)育過程中DNA去甲基化和甲基化變化
DNA甲基化的重編程涉及在人類胚胎發(fā)育的植入前和植入后期去除和重建DNA甲基化模式（圖1）。這些事件對(duì)于重置遺傳親本甲基化至關(guān)重要，從而構(gòu)建新的DNA甲基化譜。
整體DNA甲基化去除發(fā)生在植入前人類胚胎發(fā)育的幾個(gè)時(shí)期。受精后12小時(shí)內(nèi)發(fā)生了一次主要的去甲基化，其中基因間區(qū)域（如增強(qiáng)子）以及基因體區(qū)域主要發(fā)生去甲基化。從受精卵后期到2C期，然后從8C到桑椹胚和胚泡期，進(jìn)一步發(fā)生去甲基化。在這些階段，內(nèi)含子和SINE元件尤其是年輕Alu亞家族的去甲基化很明顯。小鼠中有幾個(gè)因子與受精卵的快速去甲基化有關(guān)，最顯著的是TET3，小鼠胚胎分析顯示，去甲基化位點(diǎn)在5hmC中大量富集。TET3在人卵母細(xì)胞中也高表達(dá)；然而，介導(dǎo)去甲基化過程的機(jī)制以及不同機(jī)制是否在不同時(shí)期起作用仍有待在人類胚胎中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
幾項(xiàng)研究進(jìn)一步確定了父源基因組和母源基因組之間去甲基化存在顯著差異。與小鼠類似，人類精子的甲基化水平高于卵母細(xì)胞，在胚胎植入前的所有時(shí)期，父源基因組經(jīng)歷更快的去甲基化，而母源基因組在所有植入前階段都保持較高的殘留甲基化水平。除了不同的親本效應(yīng)外，甲基化標(biāo)記的基因組位點(diǎn)也存在差異，從而在受精卵的兩個(gè)親本基因組之間產(chǎn)生差異甲基化區(qū)域：父本高甲基化區(qū)域在基因間區(qū)域相對(duì)富集，而母本高甲基化區(qū)域在基因內(nèi)區(qū)域富集，包括外顯子和內(nèi)含子。這些母系遺傳的甲基化標(biāo)記中的一些一直持續(xù)到胚泡期和胎盤中。除了幾個(gè)特定序列外，由于親本基因組之間的大多數(shù)DNA甲基化差異似乎不影響植入前階段的等位基因特異性基因表達(dá)，親本特異性甲基化的功能重要性仍不確定。
發(fā)育中的胚胎中的大多數(shù)常染色體基因都在兩個(gè)基因組中表達(dá)，但一組印跡基因表現(xiàn)出親本依賴性表達(dá)，其中一個(gè)拷貝被關(guān)閉。在這些印跡基因中，一個(gè)等位基因在配子發(fā)生過程中在其相應(yīng)的初級(jí)印跡調(diào)控區(qū)（ICR）被DNA甲基化標(biāo)記。為保護(hù)ICR免受去甲基化，在人類發(fā)育過程中保護(hù)ICR的蛋白質(zhì)開始被發(fā)現(xiàn)，并且可能具有物種特異性。其他逃脫DNA去甲基化區(qū)域由一個(gè)年輕的LINE家族代表，特別是L1PA家族。這表明了一種保護(hù)機(jī)制，可以防止這些進(jìn)化上年輕的轉(zhuǎn)座元件激活。
盡管在植入前發(fā)育過程中發(fā)生了甲基化丟失，但從4C期到8C期也發(fā)生了de novo DNA甲基化。新的甲基化區(qū)域在重復(fù)元件富集，例如SINE，LINEs和長末端重復(fù)序列（LTR）。且經(jīng)歷de novo甲基化的區(qū)域通常在桑椹胚和囊胚期再次去甲基化，強(qiáng)調(diào)了甲基化變化的瞬時(shí)性和動(dòng)態(tài)性。
DNA甲基化對(duì)植入后胚胎發(fā)育的影響
在人類囊胚中，ICM和滋養(yǎng)外胚層具有相似的DNA甲基化譜，表明滋養(yǎng)外胚層的初始誘導(dǎo)在很大程度上獨(dú)立于DNA甲基化。然而DNA甲基化如何影響人類胚胎的譜系成熟和植入后發(fā)育是關(guān)鍵問題。植入后人類胚胎的DNA甲基化組分析表明，相當(dāng)大的DNA再甲基化發(fā)生在E7和E12之間。調(diào)節(jié)de novo甲基化機(jī)制已在小鼠中得到表征，但DNMT3A和DNMT3B的相對(duì)功能貢獻(xiàn)（兩者在植入后在人類胚胎中轉(zhuǎn)錄上調(diào)）仍有待在人類植入后發(fā)育中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。人類胚胎的外胚層，滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)胚層在DNA de novo甲基化模式中具有顯著的變異性和不同步性。特別是植入后，植入后，與外胚層和滋養(yǎng)外胚層譜系的細(xì)胞相比，內(nèi)胚層的DNA再甲基化速度較慢，并且在同一發(fā)育時(shí)期，內(nèi)胚層的中位DNA甲基化水平約為外胚層的一半(33%：60%)。這表明盡管外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞都起源于ICM，但它們具有不同的DNA再甲基化機(jī)制。也許這表明在這個(gè)特定的發(fā)育時(shí)期，相對(duì)于外胚層譜系，內(nèi)胚層具有更大的發(fā)育可塑性。
三個(gè)譜系中的DNA再甲基化也發(fā)生在具有譜系特異性表征的特定基因組元件上。在植入后人類發(fā)育過程中，超過200個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化。此外，E8的每個(gè)細(xì)胞譜系都具有特定的甲基化模式：外胚層相關(guān)基因的啟動(dòng)子在滋養(yǎng)外胚層中被甲基化，但在外胚層和內(nèi)胚層譜系中均未被甲基化。相比之下，滋養(yǎng)外胚層限制基因的啟動(dòng)子在外胚層和內(nèi)胚層譜系中被甲基化，內(nèi)胚層相關(guān)基因啟動(dòng)子在外胚層和滋養(yǎng)外胚層譜系中被甲基化。這些發(fā)現(xiàn)表明DNA甲基化一旦形成，可能有助于維持不同的譜系命運(yùn)。
通過原腸胚形成和神經(jīng)形成期培養(yǎng)食蟹猴胚胎的新方法，為研究植入后胚胎的表觀遺傳變化提供了機(jī)會(huì)。單細(xì)胞多組學(xué)分析結(jié)果表明，食蟹猴胚胎在每種鑒定的細(xì)胞類型中都會(huì)經(jīng)歷特定的DNA甲基化模式。胚胎細(xì)胞的DNA甲基化水平明顯高于胚外細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)與先前在小鼠和人類中的報(bào)道一致。重要的是，食蟹猴胚胎中的啟動(dòng)子區(qū)域、LINEs、LTR區(qū)域和SINEs在食蟹猴胚胎中顯示出與在每種細(xì)胞類型中觀察到的總體DNA甲基化相似模式。然而，這些元件中的每一個(gè)都表現(xiàn)出不同程度的甲基化，這與小鼠的觀察結(jié)果一致。
總之，DNA甲基化在早期胚胎發(fā)生過程中是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過程，涉及一系列的去甲基化和de novo甲基化。關(guān)鍵的問題包括：植入后人類胚胎發(fā)育中DNA甲基化的譜系特異性變化、基因組特征和功能調(diào)節(jié)因子是什么？植入前和植入后的物種特異性DNA甲基化模式是什么，這些信息可以更全面地了解進(jìn)化過程中保守的DNA甲基化模式？
人類發(fā)育表觀遺傳學(xué)的重要性
確保胚胎發(fā)生過程中忠實(shí)的表觀遺傳調(diào)控的重要性不僅體現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)研究，而且還體現(xiàn)在表觀遺傳過程破壞的個(gè)體發(fā)育結(jié)果以及在某些人類胚胎模型和類器官中喪失表觀遺傳保真度中。
在模式生物中，許多表觀遺傳調(diào)節(jié)因子編碼基因的純合突變會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)育失敗。據(jù)推測(cè)，人類類似功能喪失突變也會(huì)導(dǎo)致早期妊娠丟失。人類其他突變(通常為雜合突變或半合突變)通常與發(fā)育一致，但可引起多種先天性疾病，包括Rubinstein-Taybi綜合征(乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP和p300編碼基因突變)、ICF綜合征(通常與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B編碼基因突變相關(guān))和Kabuki綜合征(影響組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2D遺傳變異)。
另一個(gè)重要特征是表觀基因組建立可以使早期人類胚胎特別容易受應(yīng)激或表觀基因組改變過程中的變化影響。這種脆弱性與理解早期環(huán)境暴露的后果以及體外培養(yǎng)改變卵母細(xì)胞和植入前胚胎表觀基因組的潛力相關(guān)。鑒于輔助生殖技術(shù)的日益普及，目前的工作至關(guān)重要，以確定這些技術(shù)對(duì)發(fā)育表觀基因組的影響。
最后，必須強(qiáng)調(diào)的是，廣泛應(yīng)用的體外細(xì)胞模型也可能發(fā)生異常表觀基因組變化。hPSCs基因組印記和XCI變化影響胚胎模型和這些細(xì)胞系源類器官的保真度。進(jìn)一步的意義是，目前由初始hPSCs生成的大多數(shù)人類母細(xì)胞模型由于異常印記而存在“內(nèi)在缺陷”。由于印記基因的忠實(shí)調(diào)控是哺乳動(dòng)物發(fā)育所必需的，因此這一缺陷可能會(huì)限制人類母細(xì)胞持續(xù)發(fā)育的能力。未來的培養(yǎng)方法無疑將支持在初始hPSCs中維持正常印記，但在短期內(nèi)，這一表觀遺傳異常對(duì)有關(guān)母細(xì)胞和其他胚胎模型的發(fā)育潛力和生存力的科學(xué)、倫理和政策討論具有影響。即使在hPSCs中大多數(shù)印記達(dá)到了完美的保真度，重要的是要注意，胎盤特異性DNA甲基化印記在包括hPSCs在內(nèi)的表母細(xì)胞來源的細(xì)胞系中缺失。胎盤印記及其相關(guān)基因的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)破壞hPSCs來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)和生長，因此，這種內(nèi)在的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)也可能影響hPSCs來源的胚外細(xì)胞類型的干細(xì)胞胚胎模型的保真度。
參考文獻(xiàn)：
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背景（Introduction）
表觀基因組在胚胎發(fā)育的最初幾天會(huì)發(fā)生巨大變化。表觀基因組重置和建立在胚胎發(fā)生的更廣泛過程中進(jìn)行協(xié)調(diào)和促進(jìn)。因此需要表觀遺傳調(diào)控來保護(hù)發(fā)育并建立在整個(gè)生命過程中對(duì)基因組功能有影響的長期表觀遺傳狀態(tài)。
表觀遺傳信息通過告訴細(xì)胞它們的過去、現(xiàn)在和未來來促進(jìn)胚胎發(fā)育。它提供了對(duì)所做決定和過去遇到情況的分子記憶，將早期事件作為化學(xué)標(biāo)記整合到基因組中并穩(wěn)定傳遞。這些標(biāo)記也會(huì)預(yù)示未來事件，尤其是譜系分化決定，并由不同的表觀遺傳調(diào)節(jié)因子的調(diào)控下發(fā)揮廣泛作用，這些調(diào)節(jié)因子本身具有不同的功能并劃分不同的基因組元件。多種表觀遺傳通路（包括染色質(zhì)重塑、組蛋白修飾和DNA甲基化）的協(xié)調(diào)調(diào)控著基因時(shí)空表達(dá)，并嚴(yán)格限制胚胎發(fā)生過程中重復(fù)元件的必要但潛在有害的活動(dòng)。
受精后，高度特化的精子和卵母細(xì)胞的表觀基因組被重編程，以建立適合胚胎發(fā)育的全能性狀態(tài)。母系遺傳因素在受精后的前3天維持人類胚胎的分裂，然后在4細(xì)胞期(4C)到8細(xì)胞(8C)期發(fā)生胚胎基因組激活(embryonic genome activation，EGA)的主要波。經(jīng)過EGA后，人類胚胎首先形成桑葚胚，然后形成具有明確內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的早期囊胚，植入囊胚有三種不同的細(xì)胞系：上胚層(epiblast，產(chǎn)生所有胎兒組織)、下胚層(hypoblast，形成卵黃囊)和滋養(yǎng)外胚層(trophectoderm，后來形成胎盤)。在接下來的一周內(nèi)，胚胎形成額外的胚胎外譜系，外胚層開始按照原腸胚形成的預(yù)期進(jìn)行定型，這在胚胎發(fā)生的第三周開始。
關(guān)于人類胚胎發(fā)生的許多知識(shí)來自于對(duì)組織學(xué)的集合研究。最近改進(jìn)的方法使人類胚胎的體外培養(yǎng)和研究成為可能，直到大約胚胎第14天(E)。與此同時(shí)，由于人類胚胎研究存在重大技術(shù)和倫理挑戰(zhàn)，大量的體外系統(tǒng)旨在復(fù)制全部或部分早期人類胚胎。這些細(xì)胞包括反映原腸胚形成前期的細(xì)胞，包括8c樣細(xì)胞(8clc)、初始和啟動(dòng)的人多能干細(xì)胞(hPSCs)和譜系限制性細(xì)胞系。其中一些細(xì)胞類型還提供了構(gòu)建更復(fù)雜結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)，如基于干細(xì)胞的整合模型(囊胚和植入后組裝體)和非整合模型，如原腸樣細(xì)胞。
本綜述討論了早期人類發(fā)育的表觀遺傳表征的新見解。這些研究對(duì)于理解表觀遺傳過程如何幫助調(diào)控和協(xié)調(diào)人類胚胎發(fā)生，以及表觀遺傳過程如何在這一時(shí)期與其他細(xì)胞和分子通路協(xié)調(diào)發(fā)生具有重要意義。對(duì)表觀遺傳過程的深入了解也將揭示表觀基因組對(duì)遺傳和環(huán)境變異的脆弱性。盡管重點(diǎn)是人類胚胎發(fā)育，但在相關(guān)條件下與其他物種的新數(shù)據(jù)以及基于干細(xì)胞的胚胎模型進(jìn)行了比較。這些替代系統(tǒng)對(duì)于幫助建立發(fā)育過程中表觀遺傳過程的因果關(guān)系至關(guān)重要。此外還概述了當(dāng)前的知識(shí)差距和關(guān)鍵的未決問題。
染色質(zhì)重塑：打開胚胎基因組以塑造發(fā)育程序
在人類胚胎發(fā)生期間，染色質(zhì)廣泛重塑以改變其可及性，最大變化與關(guān)鍵發(fā)育的重要階段重合(圖1)。染色質(zhì)可及性可定義為DNA可用于因子(包括轉(zhuǎn)錄機(jī)制和表觀遺傳修飾因子)結(jié)合的程度，其中主要決定因素包括核小體密度和間距。這樣，染色質(zhì)可及性代表了區(qū)域調(diào)控基因表達(dá)的潛力。
圖1：人類胚胎發(fā)育中的整體表觀基因組變化
酶的DNA可及性是用于定量染色質(zhì)可及性的技術(shù)基礎(chǔ)。這些酶既可以切割可及DNA (DNase-seq和ATAC-seq)，也可以甲基化可及胞嘧啶(NOMe-seq)，這兩種酶都可以通過高通量測(cè)序進(jìn)行檢測(cè)。將這些方法應(yīng)用于微量（low-input）和單細(xì)胞（single-cell）應(yīng)用，能夠?qū)θ祟惻咛サ娜旧|(zhì)可及性進(jìn)行分析。
這些研究的一致發(fā)現(xiàn)是，在2-細(xì)胞(2C)和囊胚期之間，人類胚胎基因組中已鑒定的可接近區(qū)域的數(shù)量逐漸增加(圖1)。不同研究中增加的程度有很大差異，可能是由于用于鑒定可接近染色質(zhì)的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法不同。但總體趨勢(shì)一致。與可接近區(qū)域的數(shù)量相反，在增加到囊胚期之前，從受精卵到8C期的總?cè)旧|(zhì)可及性(通過基于甲基化的基因組中可及胞嘧啶比例定量確定)短暫降低。這一模式可能表明人類受精卵具有全基因組開放的染色質(zhì)狀態(tài)，這是切割方法無法檢測(cè)到的�？傊�，這些染色質(zhì)可及性的動(dòng)態(tài)變化支持基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(GRNs)在早期發(fā)育過程中多次重塑，以建立新的發(fā)育程序。
受精卵的初始重塑定義pre-EGA染色質(zhì)可及性
在整個(gè)人類胚胎發(fā)育過程中，可及性區(qū)域富集了啟動(dòng)子、CpG島和遠(yuǎn)端調(diào)控元件(如增強(qiáng)子)，與卵母細(xì)胞相比，超過8000個(gè)啟動(dòng)子在人類受精卵中獲得可及性，這些啟動(dòng)子通常在植入前發(fā)育的整個(gè)過程中保持開放狀態(tài)。
鑒于胚胎基因組的主要轉(zhuǎn)錄直到EGA才發(fā)生，那么在8C期之前大量可及性染色質(zhì)區(qū)域的功能是什么?一種可能性是這些染色質(zhì)變化是親本基因組從配子狀態(tài)重塑到胚胎狀態(tài)的副作用。卵母細(xì)胞的染色質(zhì)相對(duì)開放，而精子的染色質(zhì)高度濃縮在人類胚胎中，受精后父源基因組的可及性迅速增加，達(dá)到高于母源基因組的水平。這種不對(duì)稱差異一直維持至4C期，此時(shí)母本和父本基因組的可及性在EGA中相等。
另一種可能性是在受精卵中獲得可及性區(qū)域支持次要EGA，即少量基因在主要pre-EGA轉(zhuǎn)錄。然而這并不能完全解釋在pre-EGA胚胎中存在數(shù)千個(gè)可及區(qū)域。第三種情況與發(fā)育基因調(diào)控相關(guān)。人類2C胚胎中的大多數(shù)可及啟動(dòng)子也在8C期獲得，盡管這些啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄不在2C期發(fā)生，但其中許多基因后來在8C期表達(dá) (圖2A)。因此，這些可接近啟動(dòng)子可能在2C期“蓄勢(shì)”以備以后的激活，這意味著pre-EGA染色質(zhì)譜的建立可能對(duì)EGA主要基因子集的及時(shí)表達(dá)非常重要。這種pre-EGA啟動(dòng)子形式已經(jīng)在斑馬魚中報(bào)道過，在人類胚胎中，在pre-EGA獲得可及性區(qū)域在代謝和生物合成等功能上富集。單細(xì)胞方法表明，相同胚胎期的單個(gè)細(xì)胞之間總是可接近這些區(qū)域 (圖2B)。與在早期發(fā)育后期獲得可及性或以更異質(zhì)性方式獲得可及性的基因相比，這種早期可及性獲得同質(zhì)模式的基因在EGA后表達(dá)更高。因此，pre-EGA染色質(zhì)可及性景觀也可能為重要的管家（housekeeping）基因提供高水平表達(dá)的基礎(chǔ)，從而為發(fā)育過程的發(fā)生提供基礎(chǔ)。
圖2：人類植入前胚胎發(fā)育中染色質(zhì)可及性和組蛋白修飾的區(qū)域特異性動(dòng)態(tài)變化
- 植入前胚胎發(fā)育過程中PMD、啟動(dòng)子和遠(yuǎn)端調(diào)控元件(包括增強(qiáng)子)的組蛋白修飾。
- 同一胚胎細(xì)胞在Pre-EGA和Post-EGA期的染色質(zhì)可及性在管家基因中的變化，這些基因在Pre-EGA均勻可及，在Post-EGA表現(xiàn)出高表達(dá)；在發(fā)育基因中，這些基因在Pre-EGA不可及，在Post-EGA表現(xiàn)出不同水平的可及性和表達(dá)。
EGA的主要染色質(zhì)可及性重塑
早期人類胚胎中染色質(zhì)可及性的最大差異，特別是在啟動(dòng)子上，區(qū)分了4C和早期與8C和后期。這個(gè)分離點(diǎn)與EGA一致，事實(shí)上，大多數(shù)在EGA轉(zhuǎn)錄上調(diào)的基因在4C和8C期之間變得可接近。
這種染色質(zhì)譜的重塑在EGA中是否具有功能作用？單細(xì)胞中染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析顯示，從2C到桑椹胚期的基因表達(dá)動(dòng)態(tài)反映在其啟動(dòng)子和假定的遠(yuǎn)端調(diào)控區(qū)的可及性動(dòng)態(tài)。這些關(guān)系的因果關(guān)系尚不清楚。許多啟動(dòng)子在EGA處表現(xiàn)出其可及性區(qū)域擴(kuò)大，這與轉(zhuǎn)錄增加一致。然而在經(jīng)轉(zhuǎn)錄抑制劑α-amanitin處理的胚胎中，大多數(shù)啟動(dòng)子的可及性區(qū)域都會(huì)擴(kuò)大。這表明，至少對(duì)于啟動(dòng)子來說，可及性增加主要先于基因表達(dá)增加。相反，可接近啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄非依賴性擴(kuò)大可以通過重新定位核小體的整體過程來介導(dǎo)。相反，α-amanitin處理也導(dǎo)致8C胚胎具有類似于Pre-EGA胚胎的遠(yuǎn)端調(diào)節(jié)元件可及性。這表明轉(zhuǎn)錄對(duì)于EGA染色質(zhì)可及性的改變是必要的，至少在遠(yuǎn)端元件是如此�？傊�，調(diào)控區(qū)域染色質(zhì)可及性與基因表達(dá)相關(guān)；然而染色質(zhì)可及性變化可能在不同的調(diào)控區(qū)環(huán)境中驅(qū)動(dòng)或反映EGA結(jié)果。
染色質(zhì)可及性變化與譜系特異性有關(guān)
從人類發(fā)育的桑葚胚期及其以后在其啟動(dòng)子處獲得可及性的基因在發(fā)育過程中富集。這一可及性的增加先于第一次譜系決定，表明染色質(zhì)可及性可能在細(xì)胞譜系分離過程中對(duì)GRN形成具有重要的功能。僅從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)就可以推斷出GRN。然而，在GRN分析中納入染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)可提高準(zhǔn)確性，特別是對(duì)于人類胚胎數(shù)據(jù)等低樣本量的數(shù)據(jù)，并且可以預(yù)測(cè)增強(qiáng)子相關(guān)性。這些方法在人類囊胚譜系中鑒定出保守的GRN，由JUND和SOX4組成，它們共同調(diào)節(jié)TFAP2C表達(dá)，而TFAP2C又調(diào)控GCM1表達(dá)。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了染色質(zhì)可及性圖譜對(duì)于理解GRN在早期胚胎發(fā)育過程中如何變化的價(jià)值。
可能影響細(xì)胞命運(yùn)決定的另一個(gè)重要特征是，染色質(zhì)可及性(尤其是啟動(dòng)子)的細(xì)胞間變化從桑葚胚期開始顯著增加(圖1)。啟動(dòng)子可及性與這些區(qū)域的基因表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)，這意味著啟動(dòng)子可及性變化可能驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)變化(圖2B)。同時(shí)，ICM調(diào)節(jié)因子(OCT4、KLF和SOX家族)和滋養(yǎng)細(xì)胞外胚層調(diào)節(jié)因子(GATA和TEAD家族)的motif區(qū)域富集。因此，胚胎內(nèi)染色質(zhì)可及性異質(zhì)性可能提供了細(xì)胞命運(yùn)決定的靈活性，或使細(xì)胞偏向于特定命運(yùn)。
盡管人類胚胎中介導(dǎo)與譜系分離和變化相關(guān)的染色質(zhì)可及性變化因子尚未鑒定，但有幾個(gè)很有前景的線索。這包括早期小鼠胚胎發(fā)育所需的核小體重塑復(fù)合物(SWI/SNF、CHD和ISWI) ，以及與初始hPSCs中的外胚層轉(zhuǎn)錄因子OCT4相關(guān)的核小體重塑SNF2家族亞基，以調(diào)節(jié)囊胚譜系基因。此外雖然在人類植入前發(fā)育的所有階段，可及性和DNA甲基化之間呈負(fù)相關(guān)，但在同一胚胎期細(xì)胞中，染色質(zhì)可及性最可變區(qū)域是最一致的低甲基化區(qū)域。這表明低甲基化可能支持染色質(zhì)可及性變化。這可能通過允許甲基化微小變化驅(qū)動(dòng)核小體占位實(shí)質(zhì)性變化，從而實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)可及性�；蛘叩图谆赡軜�(gòu)成一種允許其他因子(包括轉(zhuǎn)錄因子)結(jié)合的狀態(tài)，而轉(zhuǎn)錄因子又根據(jù)可變的可利用性影響染色質(zhì)可及性。通過這種方式，染色質(zhì)重塑和DNA甲基化互作可能有助于人類早期發(fā)育的細(xì)胞可塑性。
對(duì)于大多數(shù)啟動(dòng)子，post-EGA期可及性增加與該階段各自基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)。然而其他基因顯示出更復(fù)雜的關(guān)系，可能意味著調(diào)控發(fā)育基因的不同機(jī)制。高達(dá)30%啟動(dòng)子在8C或桑椹胚期可及，但在post-EGA植入前期沒有表達(dá)。這些啟動(dòng)子可以在植入后期被激活。雖然這種可能性需要進(jìn)一步研究，但一項(xiàng)相關(guān)發(fā)現(xiàn)是8CLC可及區(qū)域富集通常與原腸胚形成后譜系相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子motif。這些可及基因可能在早期表達(dá)，但在被其他過程沉默時(shí)保持其可及性。一個(gè)例子是EGA基因在桑葚胚期被沉默。
人類胚胎植入后的染色質(zhì)可及性還有待研究。因此染色質(zhì)可及性譜如何在植入后譜系中解決仍然未知。然而染色質(zhì)可及性已在食蟹猴胚胎植入后發(fā)育中進(jìn)行了研究。該研究結(jié)果表明，染色質(zhì)可及性在原始條索狀細(xì)胞中達(dá)到峰值，之后在分化較強(qiáng)的胚層譜系中下降(圖1)。這在人類胚胎中是否保守具有重要意義。為此研究者在基于干細(xì)胞植入后人類發(fā)育模型中共同研究了染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，以研究這一人類模型對(duì)靈長類胚胎是否顯示出類似的染色質(zhì)可及性動(dòng)態(tài)變化，以及植入后的譜系命運(yùn)是否可能在發(fā)育早期就已確定。
總之染色質(zhì)重塑改變了早期人類胚胎發(fā)育的多個(gè)時(shí)期可及性圖譜，并涉及從胚胎轉(zhuǎn)錄激活到未來基因表達(dá)鑒定等廣泛過程。關(guān)鍵問題包括：啟動(dòng)子狀態(tài)是否持續(xù)至植入后階段？染色質(zhì)可及性變化是否指導(dǎo)細(xì)胞命運(yùn)決定，這種變化的誘導(dǎo)因子？人類胚胎發(fā)育背景下可及性區(qū)域廣度如何影響區(qū)域調(diào)控潛力？轉(zhuǎn)錄因子、核小體重塑因子和轉(zhuǎn)錄本身可能部分導(dǎo)致染色質(zhì)可及性變化。然而染色質(zhì)重塑發(fā)生在更廣泛的表觀遺傳重編程背景下，因此DNA甲基化和組蛋白修飾變化也可能有助于染色質(zhì)重塑的最終功能結(jié)局。
組蛋白修飾：基因組激活和發(fā)育基因的動(dòng)態(tài)調(diào)控因子
與染色質(zhì)可及性相似，組蛋白修飾在發(fā)育過程中也高度動(dòng)態(tài)(圖1)。組蛋白修飾變化普遍存在，發(fā)生在不同的發(fā)育時(shí)期和不同類型的基因組區(qū)域之間。組蛋白修飾具有組合作用，大致可分為兩類：(1)促進(jìn)性染色質(zhì)相關(guān)修飾，如啟動(dòng)子上的H3K4me3，增強(qiáng)子和其他基因間區(qū)域的H3K4me1，以及活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子上的H3K27ac；(2)抑制性染色質(zhì)相關(guān)修飾，如H3K27me3和H3K9me3。每一種修飾又會(huì)招募下游效應(yīng)因子，進(jìn)而介導(dǎo)對(duì)基因組功能和活性的進(jìn)一步影響�？梢宰R(shí)別或調(diào)節(jié)組蛋白的系統(tǒng)具有多種亞基、亞型和變異體，其復(fù)雜性非常巨大，而且還在不斷擴(kuò)大。
發(fā)育過程中組蛋白修飾圖譜繪制落后于其他表觀遺傳標(biāo)記，主要是因?yàn)榻M蛋白分析方法通常需要數(shù)千~數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞，因此與可用胚胎細(xì)胞數(shù)量匹配。同時(shí)也已經(jīng)開發(fā)出需要更少樣本的方法，例如low-input染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-seq）、CUT&RUN和CUT&Tag，并已被用于生成第一個(gè)人類胚胎和其他物種的組蛋白修飾圖。
卵母細(xì)胞和早期胚胎中的經(jīng)典和非經(jīng)典組蛋白修飾模式
在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞和早期胚胎生長過程中，組蛋白標(biāo)記沉積在時(shí)間和空間上受到高度調(diào)節(jié)。人類和其他哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞含有較大的非轉(zhuǎn)錄部分DNA甲基化結(jié)構(gòu)域（PMDs）。在大多數(shù)哺乳動(dòng)物物種中，卵母細(xì)胞中的PMD由H3K4me3標(biāo)記。但在人類卵母細(xì)胞中，PMDs沒有被H3K4me3標(biāo)記，相反卵母細(xì)胞在基因啟動(dòng)子處具有H3K4me3強(qiáng)富集的狹窄區(qū)域的典型模式，精子中也存在類似的模式（圖2A）。受精后，2C和4C人類胚胎在卵母細(xì)胞遺傳的PMD中獲得中等水平的H3K4me3。這樣pre-EGA人類胚胎獲得了在這個(gè)發(fā)育期與小鼠胚胎更相似的一種整體H3K4me3模式。然而與小鼠相比，人類卵母細(xì)胞PMDs中H3K4me3增加是有限，因?yàn)檫@些區(qū)域的H3K4me3水平相對(duì)于啟動(dòng)子中的H3K4me3水平較低，并且也僅限于富集基因的卵母細(xì)胞的PMD子集。此外一些啟動(dòng)子獲得H3K4me3，與轉(zhuǎn)錄無關(guān)，但似乎反映了活性甲基轉(zhuǎn)移酶的靶向性，特別是對(duì)未甲基化的CpG富集區(qū)域。在小鼠中，H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2B在啟動(dòng)子和PMD上以不依賴轉(zhuǎn)錄的方式催化H3K4me3，并可能在pre-EGA人類胚胎發(fā)揮類似作用。
其他組蛋白修飾的式在物種間更為保守。在人類和其他物種的卵母細(xì)胞中，PMD具有廣泛的H3K27me3覆蓋率。雖然這種覆蓋率功能尚不確定，但小鼠卵母細(xì)胞和早期胚胎中較大的基因間H3K27me3修飾區(qū)域形成了自我互作結(jié)構(gòu)域，據(jù)推測(cè)這些結(jié)構(gòu)域可以劃分母本基因組以誘導(dǎo)抑制重復(fù)元件。H3K27me3也存在于人類卵母細(xì)胞、精子和早期胚胎中，位于與發(fā)育基因啟動(dòng)子重疊的強(qiáng)富集典型位點(diǎn)。H3K9me3相對(duì)于其他胚胎期，在人類卵母細(xì)胞的基因密集區(qū)域富集，這可能提供了抑制卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的另一種機(jī)制。
到2C期，大多數(shù)精子遺傳的H3K27me3丟失，而卵母細(xì)胞特異性H3K27me3被短暫保留，然后在4C期去除。這些動(dòng)態(tài)變化與受精后的牛和豬胚胎相似，但與小鼠胚胎不同，小鼠胚胎在囊胚期前保留了一些卵母細(xì)胞遺傳的H3K27me3。這些差異對(duì)小鼠依賴卵母細(xì)胞來源的H3K27me3維持過程具有重要意義。與受精后PMD中H3K27me3去除相一致，這些廣泛區(qū)域中的大多數(shù)基因在2C和4C胚胎中被H3K27ac標(biāo)記，與H3K4me3重疊。鑒于這些結(jié)構(gòu)域在卵母細(xì)胞中被H3K27me3修飾，H3K27ac很可能在受精后的PMDs中de novo 建立。需要在人卵母細(xì)胞對(duì)H3K27ac進(jìn)行分析來證實(shí)這一假設(shè)。
特別重要的是這些表觀基因組變化是否調(diào)控EGA基因激活。可能調(diào)節(jié)EGA基因的增強(qiáng)子序列經(jīng)歷重編程，從而導(dǎo)致H3K9me3丟失，并在4C期和8C期之間更易接近性，這與EGA基因被激活時(shí)間相對(duì)應(yīng)。通過表達(dá)dCas9-KRAB誘導(dǎo)H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶的位點(diǎn)特異性募集，從而在人類胚胎中實(shí)驗(yàn)性強(qiáng)制H3K9me3的持久性，導(dǎo)致EGA基因不能完全激活和發(fā)育遲緩。這些實(shí)驗(yàn)表明EGA基因調(diào)控區(qū)域需要重塑，以調(diào)控其在發(fā)育過程中的激活時(shí)間。另一種可能性是4C胚胎中廣泛的H3K4me3結(jié)構(gòu)域有助于瞬時(shí)抑制EGA直到合適時(shí)間。這一觀點(diǎn)在小鼠和豬受精卵中H3K4me3去甲基化酶敲除的研究中得到支持，這導(dǎo)致EGA基因激活減少且未能發(fā)育到囊胚期。這表明及時(shí)解決這些大結(jié)構(gòu)域是必需步驟。成功EGA可能需要將H3K27ac的廣泛結(jié)構(gòu)域分解成narrow peaks，因?yàn)槿祟愂芫阎薪M蛋白去乙�；甘Щ钕拗艵GA基因子集轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)�？傊�，EGA前調(diào)控去除特定組蛋白修飾是確保發(fā)育進(jìn)展的主要表觀遺傳事件。
Post-EGA表觀遺傳重構(gòu)建立新的發(fā)育程序
從8C期到囊胚期人類胚胎發(fā)育涵蓋了廣泛的組蛋白修飾變化（圖2A）。這一時(shí)期的一個(gè)顯著特征是8C人類胚胎中幾乎不存在H3K27me3。這可能是由于缺乏母體提供的催化H3K27me3的polycomb蛋白，以及受精后不久H3K27me3（尤其是精子來源的H3K27me3）主動(dòng)清除。在EGA之前，啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3的去除在物種間高度保守。
8 C期EGA顯著改變了表觀遺傳修飾因子豐度，每個(gè)修飾因子都有其對(duì)經(jīng)典或非經(jīng)典靶點(diǎn)偏好。因此，EGA（母系遺傳）前與EGA（基因組轉(zhuǎn)錄）后表觀遺傳修飾因子可用性差異重塑表觀基因組。例如，Polycomb組蛋白在EGA之后轉(zhuǎn)錄，并在發(fā)育基因附近沉積H3K27me3，在此過程中將大多數(shù)CpG富集調(diào)節(jié)區(qū)域分解為活性、二價(jià)或抑制染色質(zhì)狀態(tài)（圖2A）。確認(rèn)共修飾的二價(jià)核小體（H3K27me3和H3K4me3）需要進(jìn)一步分析，如單核小體分析或ChIP分析。H3K27me3的另一個(gè)潛在功能是在EGA完成后幫助抑制啟動(dòng)EGA基因。在囊胚中，H3K27me3存在于EGA基因啟動(dòng)子處，表明其可能在影響EGA退出中發(fā)揮作用。已在牛胚胎中使用α-amanitin蛋白阻斷胚胎基因組轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)polycomb組蛋白表達(dá)。處理后胚胎的染色質(zhì)狀態(tài)保持在pre-EGA模式，表明轉(zhuǎn)錄和激活polycomb組蛋白表達(dá)是重組EGA后表觀遺傳圖譜所必需。H3K4me3水平在4C和8C期間也發(fā)生顯著變化，這與卵母細(xì)胞遺傳的PMDs中H3K4me3減少和許多基因啟動(dòng)子中H3K4me3減少有關(guān)。這些變化伴隨著H3K4去甲基化酶KDM5B的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)和H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2B的下調(diào)，盡管這些蛋白在人類胚胎中的功能作用尚未驗(yàn)證。
一個(gè)關(guān)鍵的問題是為什么胚胎在早期胚胎發(fā)生中經(jīng)歷組蛋白標(biāo)記重編程。有幾個(gè)潛在的原因：解決預(yù)先存在的染色質(zhì)狀態(tài)，去除親本遺傳的表觀遺傳標(biāo)記和表觀突變（epimutations），或支持發(fā)病和關(guān)閉EGA。無論是什么原因，一旦重置，新的染色質(zhì)狀態(tài)將繼續(xù)建立，由CpG序列存在、染色質(zhì)蛋白可用性以及與其他基因調(diào)控過程互作，從而導(dǎo)致順式調(diào)控區(qū)域的重新標(biāo)記和發(fā)育程序出現(xiàn)。
組蛋白修飾對(duì)胚胎譜系分化的影響
組蛋白修飾是否以及如何影響植入前人類胚胎的譜系命運(yùn)是重要的，尚未解決的問題。一些外胚層特異性和內(nèi)胚層特異性基因在滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞中被H3K27me3標(biāo)記，盡管大多數(shù)滋養(yǎng)外胚層特異性基因在早期胚泡的ICM細(xì)胞中基本上沒有H3K27me3。這些不對(duì)稱模式可能會(huì)隨著胚胎的發(fā)育而加強(qiáng)譜系決定。在牛胚泡中也觀察到了某些譜系調(diào)節(jié)因子的交叉抑制模。事實(shí)上，干擾H3K27me3在人胚泡細(xì)胞和初始hPSC中的沉積會(huì)導(dǎo)致從外胚層樣狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樽甜B(yǎng)外胚層樣狀態(tài)。
同樣的，可以拮抗某些轉(zhuǎn)錄因子與其靶序列結(jié)合的H3K9me3也可能有助于形成新的GRN。H3K9me3沉積中的細(xì)胞特異性差異可能通過限制早期滋養(yǎng)外胚層中的特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和激活可能促進(jìn)ICM命運(yùn)的基因來加強(qiáng)譜系障礙。為了進(jìn)一步定義GRN，繪制H3K27ac和染色質(zhì)可及性已經(jīng)確定了8C和ICM細(xì)胞中假定的活性增強(qiáng)子（圖2A）。在這些增強(qiáng)子上富集的DNA序列包括那些與譜系限制性轉(zhuǎn)錄因子的目標(biāo)motif匹配的序列。
總之，在早期人類胚胎發(fā)育過程中，組蛋白修飾在全基因組范圍內(nèi)發(fā)生重大變化，且在EGA因子和發(fā)育基因調(diào)控的特定基因組表征上發(fā)生變化。關(guān)鍵的未解決問題包括：組蛋白修飾是否調(diào)控EGA基因的及時(shí)誘導(dǎo)和隨后的抑制？染色質(zhì)修飾過程在賦予早期胚胎細(xì)胞與多譜系分化的持續(xù)能力相關(guān)的發(fā)育可塑性方面的確切作用是什么？在更多的胚胎期（包括植入后）對(duì)組蛋白修飾進(jìn)行進(jìn)一步分析，以及有針對(duì)性的表觀基因組工程和功能喪失方法，以檢測(cè)定義因子在胚胎和胚胎模型中的致病作用，將有助于克服其中一些知識(shí)空白。更廣泛地說，在其他情況下的研究已經(jīng)證實(shí)，染色質(zhì)的組蛋白狀態(tài)也決定了其他基本的細(xì)胞過程，包括DNA復(fù)制和DNA修復(fù)。更好地了解組蛋白修飾與早期人類胚胎發(fā)生中DNA復(fù)制/修復(fù)之間的關(guān)系是一個(gè)很有前景的研究方向。鑒于人類胚胎中非整倍體細(xì)胞的高發(fā)生率，這一點(diǎn)尤其重要。
DNA甲基化：保護(hù)基因組穩(wěn)定性和發(fā)育基因表達(dá)
DNA甲基化是指在胞嘧啶中添加甲基以形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC），其主要發(fā)生在CpG二核苷酸上。DNA甲基化模式由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3A和DNMT3B建立，并由DNMT1維持，非催化蛋白DNMT3L作為輔因子，在它們?nèi)笔У那闆r下，5mC通過被動(dòng)去甲基化或通過TET羥化酶將5mC氧化成5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)的主動(dòng)DNA去甲基化從基因組中去除。檢測(cè)胚胎發(fā)生過程中DNA甲基化的主要方法是用識(shí)別5mC的抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)和分析技術(shù)，包括簡化基因組甲基化測(cè)序(reduced representation bisulfite sequencing，RRBS)，全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）和PBAT甲基化測(cè)序（post-bisulfite adapter tagging）。
胚胎植入前發(fā)育過程中DNA去甲基化和甲基化變化
DNA甲基化的重編程涉及在人類胚胎發(fā)育的植入前和植入后期去除和重建DNA甲基化模式（圖1）。這些事件對(duì)于重置遺傳親本甲基化至關(guān)重要，從而構(gòu)建新的DNA甲基化譜。
整體DNA甲基化去除發(fā)生在植入前人類胚胎發(fā)育的幾個(gè)時(shí)期。受精后12小時(shí)內(nèi)發(fā)生了一次主要的去甲基化，其中基因間區(qū)域（如增強(qiáng)子）以及基因體區(qū)域主要發(fā)生去甲基化。從受精卵后期到2C期，然后從8C到桑椹胚和胚泡期，進(jìn)一步發(fā)生去甲基化。在這些階段，內(nèi)含子和SINE元件尤其是年輕Alu亞家族的去甲基化很明顯。小鼠中有幾個(gè)因子與受精卵的快速去甲基化有關(guān)，最顯著的是TET3，小鼠胚胎分析顯示，去甲基化位點(diǎn)在5hmC中大量富集。TET3在人卵母細(xì)胞中也高表達(dá)；然而，介導(dǎo)去甲基化過程的機(jī)制以及不同機(jī)制是否在不同時(shí)期起作用仍有待在人類胚胎中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
幾項(xiàng)研究進(jìn)一步確定了父源基因組和母源基因組之間去甲基化存在顯著差異。與小鼠類似，人類精子的甲基化水平高于卵母細(xì)胞，在胚胎植入前的所有時(shí)期，父源基因組經(jīng)歷更快的去甲基化，而母源基因組在所有植入前階段都保持較高的殘留甲基化水平。除了不同的親本效應(yīng)外，甲基化標(biāo)記的基因組位點(diǎn)也存在差異，從而在受精卵的兩個(gè)親本基因組之間產(chǎn)生差異甲基化區(qū)域：父本高甲基化區(qū)域在基因間區(qū)域相對(duì)富集，而母本高甲基化區(qū)域在基因內(nèi)區(qū)域富集，包括外顯子和內(nèi)含子。這些母系遺傳的甲基化標(biāo)記中的一些一直持續(xù)到胚泡期和胎盤中。除了幾個(gè)特定序列外，由于親本基因組之間的大多數(shù)DNA甲基化差異似乎不影響植入前階段的等位基因特異性基因表達(dá)，親本特異性甲基化的功能重要性仍不確定。
發(fā)育中的胚胎中的大多數(shù)常染色體基因都在兩個(gè)基因組中表達(dá)，但一組印跡基因表現(xiàn)出親本依賴性表達(dá)，其中一個(gè)拷貝被關(guān)閉。在這些印跡基因中，一個(gè)等位基因在配子發(fā)生過程中在其相應(yīng)的初級(jí)印跡調(diào)控區(qū)（ICR）被DNA甲基化標(biāo)記。為保護(hù)ICR免受去甲基化，在人類發(fā)育過程中保護(hù)ICR的蛋白質(zhì)開始被發(fā)現(xiàn)，并且可能具有物種特異性。其他逃脫DNA去甲基化區(qū)域由一個(gè)年輕的LINE家族代表，特別是L1PA家族。這表明了一種保護(hù)機(jī)制，可以防止這些進(jìn)化上年輕的轉(zhuǎn)座元件激活。
盡管在植入前發(fā)育過程中發(fā)生了甲基化丟失，但從4C期到8C期也發(fā)生了de novo DNA甲基化。新的甲基化區(qū)域在重復(fù)元件富集，例如SINE，LINEs和長末端重復(fù)序列（LTR）。且經(jīng)歷de novo甲基化的區(qū)域通常在桑椹胚和囊胚期再次去甲基化，強(qiáng)調(diào)了甲基化變化的瞬時(shí)性和動(dòng)態(tài)性。
DNA甲基化對(duì)植入后胚胎發(fā)育的影響
在人類囊胚中，ICM和滋養(yǎng)外胚層具有相似的DNA甲基化譜，表明滋養(yǎng)外胚層的初始誘導(dǎo)在很大程度上獨(dú)立于DNA甲基化。然而DNA甲基化如何影響人類胚胎的譜系成熟和植入后發(fā)育是關(guān)鍵問題。植入后人類胚胎的DNA甲基化組分析表明，相當(dāng)大的DNA再甲基化發(fā)生在E7和E12之間。調(diào)節(jié)de novo甲基化機(jī)制已在小鼠中得到表征，但DNMT3A和DNMT3B的相對(duì)功能貢獻(xiàn)（兩者在植入后在人類胚胎中轉(zhuǎn)錄上調(diào)）仍有待在人類植入后發(fā)育中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。人類胚胎的外胚層，滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)胚層在DNA de novo甲基化模式中具有顯著的變異性和不同步性。特別是植入后，植入后，與外胚層和滋養(yǎng)外胚層譜系的細(xì)胞相比，內(nèi)胚層的DNA再甲基化速度較慢，并且在同一發(fā)育時(shí)期，內(nèi)胚層的中位DNA甲基化水平約為外胚層的一半(33%：60%)。這表明盡管外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞都起源于ICM，但它們具有不同的DNA再甲基化機(jī)制。也許這表明在這個(gè)特定的發(fā)育時(shí)期，相對(duì)于外胚層譜系，內(nèi)胚層具有更大的發(fā)育可塑性。
三個(gè)譜系中的DNA再甲基化也發(fā)生在具有譜系特異性表征的特定基因組元件上。在植入后人類發(fā)育過程中，超過200個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化。此外，E8的每個(gè)細(xì)胞譜系都具有特定的甲基化模式：外胚層相關(guān)基因的啟動(dòng)子在滋養(yǎng)外胚層中被甲基化，但在外胚層和內(nèi)胚層譜系中均未被甲基化。相比之下，滋養(yǎng)外胚層限制基因的啟動(dòng)子在外胚層和內(nèi)胚層譜系中被甲基化，內(nèi)胚層相關(guān)基因啟動(dòng)子在外胚層和滋養(yǎng)外胚層譜系中被甲基化。這些發(fā)現(xiàn)表明DNA甲基化一旦形成，可能有助于維持不同的譜系命運(yùn)。
通過原腸胚形成和神經(jīng)形成期培養(yǎng)食蟹猴胚胎的新方法，為研究植入后胚胎的表觀遺傳變化提供了機(jī)會(huì)。單細(xì)胞多組學(xué)分析結(jié)果表明，食蟹猴胚胎在每種鑒定的細(xì)胞類型中都會(huì)經(jīng)歷特定的DNA甲基化模式。胚胎細(xì)胞的DNA甲基化水平明顯高于胚外細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)與先前在小鼠和人類中的報(bào)道一致。重要的是，食蟹猴胚胎中的啟動(dòng)子區(qū)域、LINEs、LTR區(qū)域和SINEs在食蟹猴胚胎中顯示出與在每種細(xì)胞類型中觀察到的總體DNA甲基化相似模式。然而，這些元件中的每一個(gè)都表現(xiàn)出不同程度的甲基化，這與小鼠的觀察結(jié)果一致。
總之，DNA甲基化在早期胚胎發(fā)生過程中是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的過程，涉及一系列的去甲基化和de novo甲基化。關(guān)鍵的問題包括：植入后人類胚胎發(fā)育中DNA甲基化的譜系特異性變化、基因組特征和功能調(diào)節(jié)因子是什么？植入前和植入后的物種特異性DNA甲基化模式是什么，這些信息可以更全面地了解進(jìn)化過程中保守的DNA甲基化模式？
人類發(fā)育表觀遺傳學(xué)的重要性
確保胚胎發(fā)生過程中忠實(shí)的表觀遺傳調(diào)控的重要性不僅體現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)研究，而且還體現(xiàn)在表觀遺傳過程破壞的個(gè)體發(fā)育結(jié)果以及在某些人類胚胎模型和類器官中喪失表觀遺傳保真度中。
在模式生物中，許多表觀遺傳調(diào)節(jié)因子編碼基因的純合突變會(huì)導(dǎo)致早期發(fā)育失敗。據(jù)推測(cè)，人類類似功能喪失突變也會(huì)導(dǎo)致早期妊娠丟失。人類其他突變(通常為雜合突變或半合突變)通常與發(fā)育一致，但可引起多種先天性疾病，包括Rubinstein-Taybi綜合征(乙酰轉(zhuǎn)移酶CBP和p300編碼基因突變)、ICF綜合征(通常與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT3B編碼基因突變相關(guān))和Kabuki綜合征(影響組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2D遺傳變異)。
另一個(gè)重要特征是表觀基因組建立可以使早期人類胚胎特別容易受應(yīng)激或表觀基因組改變過程中的變化影響。這種脆弱性與理解早期環(huán)境暴露的后果以及體外培養(yǎng)改變卵母細(xì)胞和植入前胚胎表觀基因組的潛力相關(guān)。鑒于輔助生殖技術(shù)的日益普及，目前的工作至關(guān)重要，以確定這些技術(shù)對(duì)發(fā)育表觀基因組的影響。
最后，必須強(qiáng)調(diào)的是，廣泛應(yīng)用的體外細(xì)胞模型也可能發(fā)生異常表觀基因組變化。hPSCs基因組印記和XCI變化影響胚胎模型和這些細(xì)胞系源類器官的保真度。進(jìn)一步的意義是，目前由初始hPSCs生成的大多數(shù)人類母細(xì)胞模型由于異常印記而存在“內(nèi)在缺陷”。由于印記基因的忠實(shí)調(diào)控是哺乳動(dòng)物發(fā)育所必需的，因此這一缺陷可能會(huì)限制人類母細(xì)胞持續(xù)發(fā)育的能力。未來的培養(yǎng)方法無疑將支持在初始hPSCs中維持正常印記，但在短期內(nèi)，這一表觀遺傳異常對(duì)有關(guān)母細(xì)胞和其他胚胎模型的發(fā)育潛力和生存力的科學(xué)、倫理和政策討論具有影響。即使在hPSCs中大多數(shù)印記達(dá)到了完美的保真度，重要的是要注意，胎盤特異性DNA甲基化印記在包括hPSCs在內(nèi)的表母細(xì)胞來源的細(xì)胞系中缺失。胎盤印記及其相關(guān)基因的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)會(huì)破壞hPSCs來源的滋養(yǎng)層細(xì)胞的誘導(dǎo)和生長，因此，這種內(nèi)在的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)也可能影響hPSCs來源的胚外細(xì)胞類型的干細(xì)胞胚胎模型的保真度。
圖3：圍繞人類胚胎發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控的開放性問題以及解決這些問題的潛在解決方案
參考文獻(xiàn)：
Wilkinson AL, Zorzan I, Rugg-Gunn PJ. Epigenetic regulation of early human embryo development. Cell Stem Cell. 2023 Oct 12. pii: S1934-5909(23)00331-4. doi: 10.1016/j.stem.2023.09.010. PubMed PMID: 37858333.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
- MeRIP-seq等揭示m6A甲基化及調(diào)控因子在食管胃結(jié)合部腺癌中的作用
- 單細(xì)胞甲基化多組學(xué)分析揭示哺乳期母體低蛋白飲食對(duì)子代的跨代傳遞
- WGBS在揭示主動(dòng)DNA去甲基化缺失植物的DNA甲基化跨代增加中的應(yīng)用
- SNP分型常見問題及解決方案
- ACE等揭示產(chǎn)前不良環(huán)境暴露通過DNA羥甲基化變化介導(dǎo)子代自閉癥
- 文獻(xiàn)解讀：DNA甲基化保護(hù)早期胚胎線粒體基因組穩(wěn)定性
- 血液Target-BS揭示靶向DNA甲基化標(biāo)記水平與患者乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)
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