全基因組DNA甲基化測序揭示衰老對肝再生的表觀基因組調(diào)控機(jī)制

衰老會對肝臟再生產(chǎn)生影響。隨著時間的推移，肝臟再生能力顯著下降。肝臟體積、血流量和代謝等肝臟生理參數(shù)，以及損傷后的再生能力在人類和模型系統(tǒng)中均在老年時表現(xiàn)出下降，其中涉及許多分子機(jī)制，包括DNA甲基化依賴性基因組重塑。那么DNA甲基化變化如何介導(dǎo)衰老對肝再生的不利影響呢？

2023年02月13日，美國德克薩斯農(nóng)工健康科學(xué)中心Robert Y. L. Tsai團(tuán)隊(duì)在《BMC Biology》雜志發(fā)表題為“Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration”的研究論文，揭示了衰老對肝臟再生的不利影響。

標(biāo)題：Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration（衰老對肝再生影響的表觀基因組分析）
時間：2023-02-13
期刊：BMC Biology
影響因子：5.4
技術(shù)平臺：WGBS等
 
研究摘要
本研究利用使用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）分析了衰老和再生共同調(diào)控的小鼠肝臟中的差異甲基化基因組區(qū)域（DMR），并鑒定出其相關(guān)基因和富集通路。對衰老DMR比對基因的通路分析揭示了衰老的兩個不同階段，即2~8月齡和8~16月齡（months old，m/o）。再生DMR比對的差異表達(dá)基因（DEG）在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的通路中富集。衰老和再生的共有DMR大多數(shù)在2~8 m/o階段以同步的甲基化方向變化（正調(diào)控），但在8~16 m/o階段以反向變化（負(fù)調(diào)控）。在12個基因的啟動子/基因區(qū)域中鑒定出再生DMR在8~16 m/o階段受到衰老的負(fù)相關(guān)影響。四個再生DEG被早期衰老正調(diào)控，并受中晚期衰老DMR負(fù)調(diào)控。鉛DMR比對基因在肝臟衰老和再生中的表達(dá)譜進(jìn)行了驗(yàn)證。
 
本研究發(fā)現(xiàn)了新的DMR和受肝臟衰老和再生的負(fù)影響的基因靶點(diǎn)，從而解釋了衰老對肝臟再生的不利影響。這些發(fā)現(xiàn)對于理解衰老對肝再生生物學(xué)的表觀基因組變化具有重要意義。
 
材料方法
材料：雌性C57BL/6小鼠，2-m/o（A2）、8-m/o（A8）、16-m/o（A16）
處理：70%肝部分切除術(shù)（PHx）
WGBS：每組4個生物學(xué)重復(fù)，新鮮冷凍肝組織中純化基因組DNA，片段化至300–500bp，制備文庫、建庫測序、DMR分析等。
DEG分析：GEO數(shù)據(jù)庫下載RNA-seq原始數(shù)據(jù)，進(jìn)行差異表達(dá)基因 （DEG）分析。
qRT-PCR：從肝組織中提取總 RNA，設(shè)置6個生物學(xué)重復(fù)和2個技術(shù)重復(fù)。
 
研究結(jié)果
（1）2-8-16 m/o 小鼠肝臟衰老 DMR 的全基因組分析
通過WGBS分析2-m/o（A2）、8-m/o（A8）和/或16-m/o（A16）小鼠肝臟之間發(fā)生的全基因組DNA甲基化變化。
圖1：通過全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）鑒定和表征衰老肝臟中的差異甲基化區(qū)域（DMR）。
A. 根據(jù)三個基線年齡組（A2R0、A8R0和A16R0）的DNA甲基化水平對CpG頻率（frequency）分類直方圖，其中X軸顯示DNA甲基化水平（從0到100%），Y軸顯示CpG事件頻率。每個圖表表示4個生物學(xué)重復(fù)的平均值。
B. 比較8-m/o（A8R0）和2-m/o（A2R0）肝臟（B1），16-m/o（A16R0）和A8R0肝臟（B2），A16R0和A2R0肝臟（B3），衰老DMR的熱圖。色階表示Z值，分別用紅色或綠色表示甲基化的升高或降低。Hyper-DMR列在hypo-DMR上方。R0表示非再生狀態(tài)。
C. 比較A8R0~A2R0、A16R0~A8R0或A16R0~A2R0肝臟時，hypo-DMR（灰條）和hyper-DMR（黑條）的基因組分布�？s寫：rsmk，重復(fù)DNA區(qū)域；gBody，基因體；TSS，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；rep，重復(fù)；SINE，短散布的核元件；LINE，長散布的核元件；UTR，非翻譯區(qū)。Y軸表示在特定感興趣的基因組區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的總hypo-DMR或hyper-DMR百分比（%）（熱點(diǎn)分析）。不同的基因組區(qū)域并不相斥。
D. 在包含基因結(jié)構(gòu)的基因組區(qū)域與基因間區(qū)域（D1）或重復(fù)序列與非重復(fù)序列（D2）中鑒定出的衰老DMR百分比餅圖�？s寫：TSS-7 k，在TSS上游7kB內(nèi)；GB，基因體；IG，基因間區(qū)域；LINE，長散布的核元件；SINE，短散布的核元件；SimRep：簡單重復(fù)（微型衛(wèi)星）；Satellite，衛(wèi)星重復(fù)；Others：UCSC基因組瀏覽器中RMSK中定義的其他重復(fù)類別；nonRep：非重復(fù)區(qū)域。
 

圖2：衰老肝臟DMR示例和通路分析。
A. 基因組瀏覽器（TRACK）視圖顯示與Myc和Rai1（A1）相關(guān)的兩個衰老hyper-DMR，和與GSK3β和Nceh1（A2）相關(guān)的兩個hypo-DMR。DMR以藍(lán)色陰影突出顯示。
B. 早期單一、晚期單一、正相關(guān)、和負(fù)相關(guān)類別中的DMR（編號）及其比對基因的數(shù)量。
C. 使用Hallmark（H）、Canonical Pathway（CP）和Gene Ontology（GO）對四種不同類型的DMR比對基因進(jìn)行GSEA分析。

（2）肝再生過程中全基因組DMR的鑒定
PHx后1d（A2R1）、2d（A2R2）和4d（A2R4），分析2-m/o（A2）肝臟樣本的DNA甲基化水平并將其與手術(shù)前收集的非再生樣本進(jìn)行比較來鑒定再生DMR（A2R0）。
圖3：通過WGBS鑒定和表征再生肝臟中的DMR。
A. 根據(jù)三個2-m/o PHx組（A2R1、A2R2和A2R4）的DNA甲基化水平對CpG事件頻率進(jìn)行分類的直方圖，其中X軸顯示DNA甲基化水平（從0到100%），Y軸顯示CpG事件頻率。每個圖表示四個生物重復(fù)樣品的平均值。
B. 與手術(shù)前收集的基線肝臟相比，在70%部分肝切除術(shù)（PHx）后1d（A2R1）、2d（A2R2）和4d（A2R4）收集的再生2m/o肝臟中鑒定的再生DMR熱圖（A2R0）。Hyper-DMR列在hypo-DMR上方。
C. 由R1:R0（紅色），R2:R0（綠色）和/或R4:R0（藍(lán)色）組共有的特異性和重疊的hypo-DMR和hyper-DMR維恩圖。
D. 比較A2R2和A2R0肝臟樣品，再生DMR的基因組分布。
E. 基因組瀏覽器（TRACK）視圖顯示與Sox9和Errfi1（E1）相關(guān)的兩個再生hypo-DMRs和與Cbx6和Akap5（E2）相關(guān)的兩個hyper-DMRs。
 
（3）將再生DMR比對到再生中差異表達(dá)基因的啟動子區(qū)域

圖4：肝再生過程中將再生DMR比對到差異表達(dá)基因（DEG）。
A. PHx后肝再生不同時間點(diǎn)DEGs熱圖。左側(cè)顯示上調(diào)基因（上，up）和下調(diào)基因（下，dn）的數(shù)量。小時（h）、天（d）、周（w）。
B. 在R1:R0、R2:R0和R4:R0組中，再生hypo-DMR比對的上調(diào)DEG（up-DEG）和再生hyper-DMR比對的下調(diào)DEG（down-DEG）數(shù)量。
C-E. 基因集富集分析（GSEA）顯示在R1:R0（C）、R2:R0（D）和R4:R0（E）中分別由再生hypo-DMR和hyper-DMR比對的up-DEGs和down-DEG通路富集。
縮寫：H，hallmark；CP，經(jīng)典通路；GO，基因本體論；FDR，錯誤發(fā)現(xiàn)率；n1/n2，特定通路中富集的DEG數(shù)量（n1）/超過不確定DEG數(shù)（排除推定基因）（n2）.
 
（4）顯示年齡依賴性變化的再生DMR分析
圖5：衰老和再生DMR之間的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)變化。
A1.  衰老過程中高甲基化的再生hypo-DMR數(shù)量（上）和衰老過程中低甲基化的hyper-DMR數(shù)量（下）。A2.  PubMed檢索與衰老和肝臟相關(guān)的出版論文，逆齡再生hypo-DMR（upper panel）或hyper-DMR（lower panel）比對的基因列表，六個顯示肝臟相關(guān)功能（L），在再生（R）或衰老（A）中有或沒有其他功能。
B1.  在肝臟衰老和再生過程中同步低甲基化或高甲基化的DMR數(shù)量。
B2.  Hallmark (H)和Gene Ontology (GO)通路的列表富集在啟動子區(qū)域被早期(A8:A2)年齡同步再生的低DMR比對基因中。
 
（5）再生DEGs啟動子區(qū)域的年齡依賴性甲基化
圖6：再生DEG受衰老DMR負(fù)調(diào)控。許多再生的up-DEGs和down-DEGs，其啟動子區(qū)域分別在衰老早期（A8:A2）和衰老中后期（A16:A8）表現(xiàn)出低甲基化或高甲基化水平。其啟動子區(qū)域由衰老早期DMR正調(diào)控并由衰老中后期的DMR負(fù)調(diào)控的基因，B1：黃色down-DEG，B2：綠色up-DEG，受早期和中后期衰老DMR調(diào)控的基因加粗
 
（6）DMR比對基因在肝臟衰老和再生過程中的表達(dá)譜

圖7：DMR比對基因在肝臟衰老和/或再生過程中的表達(dá)譜。
A. 通過qRT-PCR分析衰老DMR比對的c-Myc，Rai1，GSK3β和Nceh1在2-m/o、8-m/o和16-m/o肝臟中的表達(dá)，分別用淺灰色、深灰色和黑色條表示。
B. PHx后2-m/o肝臟中再生DMR比對的Cbx6、Sox9和Errf1的表達(dá)。
C. 逆齡再生DMR（C1，C2）比對的兩個基因的表達(dá)譜和由早期-后期衰老負(fù)相關(guān)DMR（C3，C4）比對的兩個DEG表達(dá)譜。
D. D1通過解剖肝臟質(zhì)量（0d）或剩余肝臟質(zhì)量（1d，2d和4d）與體重的比率分析2-m/o和16-m/o肝臟再生。D2通過高倍視野（HPF= 0.126 mm2）分析Ki67數(shù)量評估2-m/o和16-m/o肝臟再生。
E. Sox9、Rap2c、Thrsp、Rspry1和Kif4在16 m/o時響應(yīng)PHx的表達(dá)譜。將表達(dá)水平相對于Rplp0作為內(nèi)部參考標(biāo)準(zhǔn)化，并與它們各自的基線（0d）或2-m/o基線（對于E5）樣品進(jìn)行比較。條形代表平均值，六個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)兩個技術(shù)重復(fù)（n = 12） 參考同一樣品的Rplp0水平*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
 
（7）DNA（羥）甲基化酶在肝再生和衰老過程中的表達(dá)

圖8：肝再生和衰老過程中DNA（羥）甲基化酶表達(dá)的變化。
A. 通過qRT-PCR在1d、2d、4d和7d的PHx之前（0d）和之后的2-m/o小鼠肝臟中Dnmts（A1）和Tets（A2）的表達(dá)。
B. DNMT和TET在2-m/o（灰色條）和16-m/o（黑色條）肝臟中的表達(dá)。
C. 在（0d）之前或在PHx（1d、2d、4d和7d）之后，Dnmts（C1）和Tets（C2）在16-m/o肝臟中的表達(dá)。
 
研究結(jié)論
本研究鑒定了在肝臟衰老和再生過程中負(fù)調(diào)控的新型DMR及其相關(guān)基因和通路，解釋了衰老對肝再生的不利影響。這些發(fā)現(xiàn)對于提高對肝再生衰老生物學(xué)基礎(chǔ)的表觀基因組變化的認(rèn)識至關(guān)重要。