表觀遺傳學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組修飾在植物金屬和準(zhǔn)金屬暴露中的作用

非必需金屬（non-essential metal）和準(zhǔn)金屬（metalloid，也稱類金屬）對土壤的污染是全球許多地區(qū)面臨的嚴(yán)重問題。這些非必需金屬和準(zhǔn)金屬對影響作物產(chǎn)量和人類健康的所有生物體均有毒性。作物暴露于高濃度的這些金屬中會導(dǎo)致礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)、光合作用效率降低、細(xì)胞分裂抑制、氧化應(yīng)激、基因毒性影響，以及隨后的生長阻礙。植物可以激活表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組機(jī)制來維持細(xì)胞和生物體穩(wěn)態(tài)。表觀遺傳學(xué)修飾包括胞嘧啶和腺嘌呤DNA堿基修飾模式變化、細(xì)胞非編碼RNA變化、組蛋白變體和共價組蛋白尾部修飾重塑。其中一些表觀遺傳學(xué)變化是持久的，可能有助于后代的應(yīng)激記憶和調(diào)控應(yīng)激耐受性。在新興的表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域，表觀轉(zhuǎn)錄組修飾（細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本中核苷酸的化學(xué)共價修飾）是基因表達(dá)的更快速調(diào)控因子。盡管在理解植物對生物和非生物脅迫的表觀遺傳學(xué)變化方面取得了重大進(jìn)展，但缺乏對植物對金屬的表觀遺傳響應(yīng)的全面綜述。雖然表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物發(fā)育過程和脅迫響應(yīng)中的作用正在顯現(xiàn)，但對金屬響應(yīng)的表觀轉(zhuǎn)錄組修飾尚未得到綜述。本文描述了對環(huán)境、植物和人類健康構(gòu)成最嚴(yán)重威脅的非必需金屬鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）、鋁（Al）和準(zhǔn)金屬砷（As）對植物中全基因組和位點(diǎn)特異性DNA甲基化、組蛋白修飾和表觀轉(zhuǎn)錄組修飾的影響。本研究對于理解植物如何響應(yīng)金屬暴露脅迫至關(guān)重要，并且可能為減輕金屬污染對農(nóng)業(yè)和環(huán)境的有害影響提供策略。
 
DNA甲基化
鎘（Cd）
鎘（Cd）的特點(diǎn)是相對較高的流動性，因此很容易被植物吸收并在植物器官內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。暴露于鎘金屬會導(dǎo)致水分和礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，降低葉綠素水平和光合作用效率。鎘誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化以及蛋白質(zhì)和核酸氧化的增加，表現(xiàn)為微核和染色體畸變水平升高。此外，暴露于鎘的植物還表現(xiàn)出超微結(jié)構(gòu)變化、種子發(fā)芽減少和生長減緩。
鎘處理植物的DNA甲基化水平和模式取決于植物種類、應(yīng)用的金屬濃度和處理時間。MSAP-PCR結(jié)果表明，在擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）中，用Cd處理導(dǎo)致外部胞嘧啶甲基化增強(qiáng)，而內(nèi)部胞嘧啶沒有觀察到顯著差異。在曼陀羅（Datura stramonium L.）植株的甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析（MSAP）結(jié)果表明，土壤和葉面施用Cd都導(dǎo)致DNA甲基化增加。在瀕危蕨類植物中華水韭(Isoetes sinensis)中，鎘和鉛誘導(dǎo)半甲基化，即DNA單鏈上的胞嘧啶甲基化。另一方面，在金屬處理的植物中觀察到完全甲基化水平降低，即雙鏈DNA上內(nèi)部和外部胞嘧啶甲基化。在大豆（Glycine max L.）中，無論是在處理后還是在恢復(fù)期七天后，Cd都不會影響ELISA檢測的整體DNA甲基化水平。在紅麻（Hibiscus cannabinus L.）中，與親本品種福紅992（CP085）和P3A（CP089）相比，雜交F1表現(xiàn)出更高的鎘耐受性和最低的DNA甲基化水平。在差異甲基化基因中，在編碼富集亮氨酸重復(fù)序列受體樣激酶（LRR-RLK）、NRT1/PTR家族蛋白質(zhì)（NPF2.7）和DEAD-box-ATP依賴性RNA解旋酶51（DHX51）的基因中觀察到對Cd響應(yīng)的低甲基化，而在編碼海藻糖磷酸磷酸酶（TTP-D）、NADP依賴性蘋果酸酶（NADP-ME）和NAC結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（NAC71）基因在對鎘響應(yīng)中也表現(xiàn)出差異表達(dá)，盡管這種模式與甲基化模式?jīng)]有直接關(guān)系。LRR-RLK和NAC71下調(diào)，而NPF2.7、DHX51、TTP-D和NADP-ME上調(diào)。另一項研究比較了金屬超積累植物Noccaea caerulescens L.和非超積累植物Arabidopsis thaliana的響應(yīng)。盡管N.caerulescens積累的鎘是A.thaliana的三倍多，但后者對鎘響應(yīng)顯示出顯著更高DNA損傷程度和更高的DNA氧化標(biāo)記物7,8-二氫8-氧代-2-脫氧鳥苷（8-oxo-dG）水平。methy-sens彗星分析結(jié)果顯示，鎘誘導(dǎo)N.caerrulescens的DNA甲基化，伴隨MET1高表達(dá)。而A. thaliana植物的特征是DNA甲基化減少、MET1表達(dá)降低和DRM2誘導(dǎo)。在超積累植物中觀察到DNA甲基化增強(qiáng)可能有助于DNA保護(hù)和更高的金屬耐受性。水稻（Oryza sativa L.）的全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）揭示了近2400個差異甲基化區(qū)域（DMR），其中基因上游區(qū)域的高甲基化是最典型響應(yīng)。甲基化基因功能分析表明大多屬于“細(xì)胞過程”、“代謝過程”和“刺激響應(yīng)”。
DNA甲基化模式變化可能通過參與甲基化或去甲基化過程的酶調(diào)控表達(dá)或活性來反映。在海草Zostera marina中，鎘暴露導(dǎo)致CMT3和DRM2甲基化酶表達(dá)增加，ROS1去甲基化酶表達(dá)減少，可能導(dǎo)致DNA 5mC水平增加。對遠(yuǎn)端短柄藻（Brachypodium distachyon）的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，Cd誘導(dǎo)了擬南芥Aly1和Aly2的直系同源Bradi4g26905基因。編碼的ALY蛋白參與mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)和DNA甲基化。在金屬超積累菌A.helleri的兩個不同種群中（源自意大利的I16種群和生長在波蘭的PL22種群），也觀察到DNA甲基化調(diào)控基因表達(dá)的鎘依賴性變化。而I16和PL22種群植物表現(xiàn)出相反的效果。PL22的 Cd暴露導(dǎo)致參與DNA甲基化的MET1、WIM1、DRM2基因以及與編碼組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶（KRYPTONITE，KYP）、組蛋白H3mK9去甲基化酶（BONSAI甲基化1，IBM1增加）和組蛋白去乙�；�酶8（HDA8）的組蛋白修飾相關(guān)的基因的表達(dá)增加，且伴有染色質(zhì)濃縮。相反，種群I16表現(xiàn)出所有上述基因的表達(dá)降低。在擬南芥中，WGBS分析顯示，Cd誘導(dǎo)DNA甲基化，主要在CHG和CHH環(huán)境中，并顯著抑制去甲基化酶ROS1、DML2和DML3的表達(dá)。ROS1、DML2和DML3表達(dá)缺失突變體具有較高的金屬耐受性和較低的鎘吸收。在Amaranthus cruentus中，在最佳條件下并響應(yīng)金屬處理評估八種甲基化酶（AcDRM2a、AcDRM2b、AcCMT1、AcCMT2a、AcCMT2b、AcCMP3、AcMET1a和AcMET1b）和兩種去甲基化酶的表達(dá)（AcDML2a和AcDML2b）。最顯著的響應(yīng)表現(xiàn)在根中，這是金屬作用的第一個位點(diǎn)。暴露于鎘、鉛和鋅誘導(dǎo)了所有分析基因的表達(dá)。AcCMT1、AcCMT2a、AcDRM2b、AcMET1和AcDML2a以及AcDML2b的強(qiáng)烈誘導(dǎo)也對組合Cd/Zn和/或Cd/Pb處理響應(yīng)。在葉片中，最顯著響應(yīng)表現(xiàn)在Pb脅迫下刺激AcDRM2a的表達(dá)。上述研究證明，鎘暴露與DNA甲基化/去甲基化機(jī)制中編碼酶的基因表達(dá)變化有關(guān)。然而，目前尚不清楚這種變化是構(gòu)成調(diào)控作用，還是Cd作用的副作用。如果是Cd作用的副作用，則可能是金屬毒性的癥狀，導(dǎo)致DNA甲基化的巨大變化，進(jìn)而導(dǎo)致影響植物整體功能的許多基因表達(dá)的變化。
鎘吸收可能依賴于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因甲基化狀態(tài)和表達(dá)水平變化。在玉米（Zea mays L.）中，鎘導(dǎo)致Met1、Met2a、Met2b、Met3a、Met3b、Met3c和Met4甲基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)顯著增加，同時IRT1、ZIP1、ZIP2和ZIP6轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的甲基化水平增加。在小麥（Triticum aestivum L.）中，比較了耐金屬品種和敏感品種響應(yīng)情況，在Cd、Pb和Zn處理下，耐金屬品種的幾個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的啟動子區(qū)甲基化水平較低。這些變化伴隨著TaABCC2、TaABCC3、TaABCC4和TaHMA2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的高表達(dá)。這種情況下，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因甲基化減弱可能促進(jìn)了金屬外排和液泡隔離，從而增強(qiáng)了耐受性。
 
鉛（Pb）
根據(jù)有毒物質(zhì)和疾病登記局（ASTDR)的數(shù)據(jù)，鉛是繼砷之后的第二種有毒重金屬/準(zhǔn)金屬，其在生物系統(tǒng)中的作用尚未完全闡明。據(jù)報道，鉛毒性的影響包括水分平衡紊亂、種子發(fā)芽減少、植物生長減緩、膜損傷、氣孔閉合和氧化損傷。鉛毒性還表現(xiàn)在對參與光合作用、氮和核酸代謝的幾種酶的抑制上，如δ-氨基戊二酸脫水酶（ALAD）、核酮糖-1,5雙磷酸鹽（Rubisco）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）、谷氨酰胺合酶、硝酸還原酶、脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶。
關(guān)于植物對鉛脅迫的表觀遺傳學(xué)響應(yīng)的報道相對較少。在玉米中，研究了鎘、鋅和鉛對選定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動子DNA甲基化的影響。研究結(jié)果表明，鉛暴露導(dǎo)致ZIP2和ZIP8啟動子的甲基化水平增加。同時，觀察到組蛋白去乙�；�酶基因（ZmHD1b、ZmHDA102、ZmHDA110、ZmHDL2a、ZMHD2b、ZmHDD 2c、ZmHD A106）表達(dá)降低。由組蛋白乙酰化和某些啟動子的DNA甲基化驅(qū)動的染色質(zhì)圖譜變化調(diào)控特定轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，反過來又影響植物對礦物質(zhì)的吸收和體內(nèi)平衡。同一項研究表明，Pb處理導(dǎo)致玉米植株的莖中鈣（Ca）水平增加，根系和莖中的鎂（Mg）水平增加，根中的Ca水平和葉片中的Mg水平下降。
在蘿卜（Raphanus sativus L.）植物中也報道了鉛對轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因甲基化和表達(dá)的影響。WGBS揭示了Pb處理和對照中11930個差異甲基化區(qū)域（DMRs），其中高甲基化是最典型的響應(yīng)。甲基化主要在CG環(huán)境中（約49%），其次是CHH（約29%）和CHG（約26%）。甲基化對基因表達(dá)有不同的影響——在76個高甲基化區(qū)域和38個低甲基化區(qū)域中下調(diào)，而72個高DMR和42個低DMR被上調(diào)。鉛處理導(dǎo)致編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的幾個基因的甲基化和表達(dá)發(fā)生顯著變化。在RsABCF5、RsABCG14和RsZIP11轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因和RsWRKY46轉(zhuǎn)錄因子中甲基化增加并伴有表達(dá)受阻。在編碼MATE外排蛋白、重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（HMT）和ZFP轉(zhuǎn)錄因子的基因中，5mC水平降低，表達(dá)增強(qiáng)。
 
鋁 （Al）
鋁（Al）是地殼中含量最豐富的金屬，是酸性土壤中主要的植物毒性物質(zhì)，歸因于其在低pH下具有高度的生物可利用性。鋁的主要作用部位是植物根部。鋁暴露會導(dǎo)致細(xì)胞壁增厚、細(xì)胞分裂受阻，從而阻礙根系生長，同時導(dǎo)致對營養(yǎng)物質(zhì)和水分吸收減少。鋁對一些必需離子（如鈣（Ca2+）和鉀（K））轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)了鋁誘導(dǎo)的營養(yǎng)缺乏。鋁植物毒性的其他癥狀包括葉片黃化和卷曲、光合作用減弱和活性氧（ROS）水平升高。
Gallo-Franco等人最近對植物對Al的表觀遺傳學(xué)響應(yīng)進(jìn)行了綜述：在包括擬南芥、小麥、玉米、煙草（Nicotiana tabacum L.）和高粱（sorghum bicolor L.Moench）在內(nèi)的多種植物對Al響應(yīng)發(fā)生DNA甲基化水平變化。一般來說Al誘導(dǎo)DNA去甲基化。如在較低耐鋁性的小黑麥品系中DNA甲基化略有下降。耐鋁品系的DNA甲基化略增加。以上結(jié)果通過反相高效液相色譜法（RP-HLPC）觀察，而不是通過甲基化敏感擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（metAFLP）或MSAP方法。
對栽培品種（Oryza sativa）和更耐鋁的野生品種（O. glumaepatula）水稻進(jìn)行全基因組甲基化比較。O.sativa中鑒定4633個差異甲基化區(qū)域（DMRs），其中38%區(qū)域甲基化增加，62%區(qū)域低甲基化。而O. glumaepatula中，72%DMR高甲基化，38%低甲基化。O.sativa的21個和O. glumaepatula的37個DMR相關(guān)基因（DAG）與Al響應(yīng)基因相關(guān)，約70個DMR位于與Al響應(yīng)基因附近的轉(zhuǎn)座元件（TEs）中。
大麥植物（Hordeum vulgare L.）通過HvAACT1（Al激活的檸檬酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）上游序列中逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入的DNA去甲基化來應(yīng)對Al脅迫，這增強(qiáng)了HvAACT2在根中的表達(dá)，從而促進(jìn)了Al外部解毒�？偟膩碚f，這些研究表明DNA甲基化機(jī)制參與了鋁耐受，然而需要進(jìn)一步研究來了解具體的機(jī)制成分。
 
汞（Hg）
汞（Hg）暴露可能導(dǎo)致應(yīng)激耐受性的長期遺傳變化，這些變化至少部分依賴于表觀遺傳修飾。因此植物可以獲得所謂的應(yīng)激記憶，不僅影響它們的應(yīng)激響應(yīng)，也影響后代響應(yīng)。例如擬南芥中，經(jīng)銅（Cu）和鎳（Ni）處理導(dǎo)致后代對這些金屬以及甲基甲烷磺酸鹽和鹽脅迫的耐受性更高。在水稻中觀察到可遺傳的甲基化模式變化，暴露于銅（Cu）、鎘（Cd）、鉻（Cr）和汞（Hg）的植物在與TE和蛋白質(zhì)編碼基因相關(guān)的序列中顯示出CGH的DNA低甲基化。DNA甲基化調(diào)控伴隨著染色質(zhì)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)變化——-主要是甲基化相關(guān)基因（MET1-2，CMT3-2）表達(dá)下調(diào)，并誘導(dǎo)去甲基化過程（DME）相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。在汞應(yīng)激下分析了響應(yīng)的可遺傳性。在汞脅迫后的第一代中觀察到三種甲基化模式：與親本植物相同的模式、進(jìn)一步低甲基化或低甲基化逆轉(zhuǎn)。其中，增強(qiáng)的低甲基化是最常見的模式。DNA甲基化模式至少部分地由S1和S2代遺傳。除了甲基化變化外，第二代植物對汞的耐受性更高，表現(xiàn)為生長抑制和葉綠素?fù)p失減弱。
在另一項關(guān)于水稻的研究中報告了幾種基因表達(dá)的可遺傳變化。經(jīng)Cu、Cd、Cr、Hg處理的植物顯示出Tos17、Osr42、HSP70、OsHMA1、osHMA2、OsHMA5-OsHMA9以及同源框（homeobox）和延伸因子編碼基因的誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)模式至少部分由來自Hg處理植物的S1和S2代的后代遺傳。為了闡明轉(zhuǎn)錄本豐度變化是否與DNA甲基化有關(guān)，分析了Tos17 TE的甲基化模式。結(jié)果表明，Hg誘導(dǎo)的甲基化模式與對照相關(guān)，且可遺傳后代。然而數(shù)據(jù)表明Tos17表達(dá)模式與甲基化之間沒有直接的相互關(guān)系，TE在暴露于Hg的植物以及后代植物中保持無活性。
使用WGBS分析了水稻甲基化組中汞依賴性變化。該研究使用Hg敏感和Hg抗性品系，其中Hg抗性品系選自O(shè)sMET1基因突變的植物。測序結(jié)果表明，高甲基化是對Hg的主要響應(yīng)。CHH變化最頻繁，CG位點(diǎn)表現(xiàn)出最高穩(wěn)定性；抗汞系的變化更為動態(tài)。在Hg處理下差異甲基化的基因包括與信號通路、應(yīng)激響應(yīng)和翻譯過程相關(guān)基因。引用的研究表明，汞會影響植物DNA甲基化狀態(tài)。然而其模式取決于應(yīng)用條件，即使在同一植物中（如水稻），一些研究顯示Hg依賴性低甲基化，而其他研究顯示高甲基化。此外所提供的數(shù)據(jù)表明，甲基化模式可以被下一代植物遺傳，并可能與它們對金屬的耐受性增強(qiáng)有關(guān)。
 
砷（As）
砷（As）在地殼中含量適中，可以以各種氧化形式存在，其中AsV和AsIII是植物最具生物利用度和植物毒性的物種。AsIII通常比AsV更具毒性，因為AsIII可以與影響其結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)巰基結(jié)合。AsV還通過細(xì)胞通路中磷酸鹽的競爭和替代負(fù)作用于植物代謝。重要的是，As可以積累在植物的可食用部分，嚴(yán)重影響人類健康。砷對水和作物的污染是全球一些地區(qū)面臨的嚴(yán)重問題，約20億人受到砷污染。長期暴露于高水平砷與皮膚癌、肝癌、肺癌、泌尿道癌、前列腺癌和血癌等多種癌癥相關(guān)。
As暴露的影響還包括表觀遺傳變化。例如在超積累植物Cretan brake fern（Pteris cretica L.）中，As導(dǎo)致DNA甲基化降低，但這種響應(yīng)僅在老葉中觀察到。而幼葉中甲基化狀態(tài)不變，且與施用的As濃度無關(guān)。有假設(shè)認(rèn)為，與金屬類似，砷的吸收受DNA甲基化調(diào)控。甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白VIM1（Variant In Methylation/Orthrus）過表達(dá)導(dǎo)致擬南芥中As耐受性較高，而這種類金屬水平較低。與野生型植物相比，VIM1缺失突變體表現(xiàn)出更高的As積累和更嚴(yán)重的毒性癥狀。更詳細(xì)的分析表明，VIM1介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動子的DNA甲基化，導(dǎo)致其表達(dá)降低并導(dǎo)致As吸收減少。
表1：金屬和準(zhǔn)金屬對DNA甲基化水平和模式的影響
DNA甲基化水平上必需和非必需金屬處理的示例：CMT-染色質(zhì)甲基化酶，DMGs-差異甲基化基因，DML-Demeter樣蛋白，DRM-結(jié)構(gòu)域重排甲基化酶，IBM-組蛋白H3mK9去甲基化酶，HDA-組蛋白去乙酰化酶，KYP-組蛋白賴氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶，MET-甲基轉(zhuǎn)移酶，ROS1-沉默阻遏蛋白，VIM1-甲基化/Orthrus變體。
 
組蛋白修飾
暴露于非必需金屬在不同水平上調(diào)控組蛋白表達(dá)，包括轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)豐度。例如在大麥中，敏金屬品系表現(xiàn)為鎘依賴性的H2A、H2B、H3和H4組蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本水平下調(diào)，而在耐金屬品系中未觀察到變化。在大豆細(xì)胞懸浮液中，鎘誘導(dǎo)H2A組蛋白的積累。金屬調(diào)控參與組蛋白修飾相關(guān)基因的表達(dá)，例如在棉花（Gossypium L.）和玉米中，與組蛋白乙�；�和去乙酰化相關(guān)的幾個基因在鎘脅迫下高表達(dá)。表達(dá)模式在同一種植物的不同品系中可能不同。Cd處理導(dǎo)致A.halleri PL22中編碼KYP、IBM1和HDA8的轉(zhuǎn)錄本豐度增加，但I(xiàn)16中的轉(zhuǎn)錄本豐度降低。蠶豆（Vicia faba）根分生組織細(xì)胞的免疫熒光技術(shù)也證明了組蛋白修飾變化。在所有三個分析的細(xì)胞周期階段（G1、S和G2）中，與對照相比，Cd處理的植物觀察到組蛋白3在賴氨酸79位（H3K79Me2）的去甲基化減少，這與復(fù)制起始事件相關(guān)。鎘暴露導(dǎo)致組蛋白3在蘇氨酸45（H3T45Ph）的磷酸化減弱，這是一種參與DNA復(fù)制過程的修飾。而在S細(xì)胞周期階段，Cd處理的植物中觀察到組蛋白3賴氨酸56（H3K56Ac）乙酰化水平增加。
金屬脅迫過程中組蛋白修飾的可能作用也在突變體植物中被報道。Jumonji-C結(jié)構(gòu)域蛋白（JMJ）屬于組蛋白去甲基酶，在Hg、Pb和Cu處理下，SIJMJ524基因在番茄植株中表達(dá)增加。SIJMJ524基因在擬南芥中的過表達(dá)調(diào)控了擬南芥對鎘的耐受性，幼苗表現(xiàn)出耐受性降低趨勢，而較老植株則表現(xiàn)出耐受性增強(qiáng)趨勢。Cd處理下，SIJMJ524過表達(dá)植株表現(xiàn)出金屬吸收（ZIP1、IRT1、COPT2、NRAMP1）和轉(zhuǎn)運(yùn)（ABCC1、PDR1、GSH1、GSH2）基因表達(dá)上調(diào)。而一些轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒相關(guān)基因表達(dá)減弱，如植物螯合蛋白合成酶（PCS1，PCS2）和谷胱甘肽還原酶（GR1）基因。酚類化合物是參與植物脅迫防御富集的次生代謝物，通過參與金屬結(jié)合、木質(zhì)素合成和壁增厚或抗氧化功能的SIJMJ524過表達(dá)調(diào)控酚類物質(zhì)合成。突變體植株黃酮積累量較高，苯丙氨酸解氨酶（PAL）和黃酮醇合酶（FLS）基因表達(dá)增加。另一方面，DFR（二氫黃酮醇4-還原酶）和CHI（查爾酮異構(gòu)酶）表達(dá)降低。
 
表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化
盡管70年前就首次描述了植物RNA修飾，但直到過去十年中才出現(xiàn)新技術(shù)的應(yīng)用，研究進(jìn)展緩慢。最近的研究表明，經(jīng)過修飾的核苷酸可以改變轉(zhuǎn)錄本半衰期、翻譯效率以及細(xì)胞和植物器官內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。然而對于RNA修飾在植物脅迫響應(yīng)中的作用，特別是對金屬和類金屬的作用，人們知之甚少。
腺苷在N6位（m6A）甲基化是植物中最常見和最廣泛的核苷酸修飾。腺苷甲基化機(jī)制中的擬南芥突變體是胚胎致死的，這一事實凸顯了其在植物發(fā)育過程中的深遠(yuǎn)意義。在成熟的擬南芥植物中，腺苷甲基化減弱導(dǎo)致維管束、毛狀體、根、蓮座葉、根和花的發(fā)育受到干擾。最近研究表明m6A與衰老相關(guān)。在植物的脅迫響應(yīng)中報告了m6A模式變化。在金屬脅迫下研究了Cd和Pb處理后大豆和暴露于Cd的大麥中的m6A。大麥7天鎘暴露通常會導(dǎo)致腺苷甲基化，在435個差異表達(dá)基因（DEGs）中，大多數(shù)（319個）表現(xiàn)出甲基化增加和RNA豐度增加。上調(diào)的甲基化轉(zhuǎn)錄本編碼的蛋白質(zhì)參與信號傳導(dǎo)（MAPK信號、激素信號）、苯丙酸通路、蔗糖和淀粉代謝、糖酵解和糖異生及轉(zhuǎn)運(yùn)（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）。GO分析表明，DEG參與氧化還原過程、轉(zhuǎn)移酶和氧化還原酶活性以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。在大豆中，鎘處理導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本中m6A的水平增加。甲基化轉(zhuǎn)錄本與植物激素信號、MAPK信號和病原互作等逆境和信號通路有關(guān)。此外，m6A轉(zhuǎn)錄本在蔗糖和淀粉、脂肪酸、氨基酸和氨酰tRNA的代謝通路中富集。高甲基化和下調(diào)的基因包括參與多胺分解代謝的基因，這些轉(zhuǎn)錄本表達(dá)減少導(dǎo)致多胺積累，并可能構(gòu)成應(yīng)激保護(hù)機(jī)制之一。有趣的是，在動物研究中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄甲基化和組蛋白修飾之間的相關(guān)性。例如H3K36me3被轉(zhuǎn)錄甲基化機(jī)制識別，導(dǎo)致m6A沉積在新轉(zhuǎn)錄的RNA中。此外，還發(fā)現(xiàn)了組蛋白修飾蛋白的表達(dá)與轉(zhuǎn)錄甲基化的關(guān)系。還發(fā)現(xiàn)m5C與其甲基化機(jī)制之間的互作可能會影響染色質(zhì)構(gòu)象。
應(yīng)激（包括金屬脅迫）的典型響應(yīng)之一是ROS穩(wěn)態(tài)失調(diào)，可能導(dǎo)致氧化損傷。另一方面，ROS也可以作為信號分子參與應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控。在核糖核酸上也可發(fā)生氧化，從而形成8-羥基鳥苷（8-OHG）。在大豆幼苗中，Cd和Pb短期處理可誘導(dǎo)總RNA和/或poly（A）RNA中8-OHG的積累。且響應(yīng)快速，僅在金屬暴露數(shù)小時后即可觀察到，且先于氧化應(yīng)激癥狀。然而，這種早期8-OHG形成在植物中的確切作用仍有待揭示。
一些研究表明，轉(zhuǎn)錄本修飾可能在植物對金屬響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。這一假說得到了其他RNA修飾，即5-甲基胞嘧啶（m5C）和8-硝基鳥苷（8-NO2-G）在植物脅迫響應(yīng)中的支持。RNA m5C甲基轉(zhuǎn)移酶的敲除導(dǎo)致擬南芥中m5C水平降低，對氧化脅迫的敏感性提高，水稻的耐熱性降低。以水稻為例，突變體的特點(diǎn)是光合作用相關(guān)基因表達(dá)較低。轉(zhuǎn)錄本上m5C水平變化導(dǎo)致光合作用裝置無法適應(yīng)脅迫條件。此外，光合作用過程的功能失調(diào)導(dǎo)致ROS積累增強(qiáng)并形成氧化依賴性損傷。接種病原菌Phytophthora infestans后，馬鈴薯植株總RNA和mRNA中的8-NO2-G修飾水平增加。與敏感品種相比，抗Phytophthora馬鈴薯品種的響應(yīng)顯著更高，表明轉(zhuǎn)錄本中8-NO2-G的積累與防御機(jī)制有關(guān)。此外，在植物病原菌結(jié)構(gòu)（P. infestans）中也觀察到8-NO2-G修飾，并且暴露于亞致死濃度的Cd誘導(dǎo)了這種類型的RNA修飾。
大多數(shù)RNA修飾的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)以及修飾轉(zhuǎn)錄本的快速轉(zhuǎn)換表明，核苷酸修飾可能作為快速開關(guān)，調(diào)控植物代謝以適應(yīng)發(fā)育和環(huán)境刺激的變化。然而這一假設(shè)需要更多的實驗支持。
 
表觀遺傳學(xué)和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化與金屬耐受性的關(guān)系
上述研究表明，非必需金屬和類金屬鎘（Cd）、鉛（Pb）、汞（Hg）、鋁（Al）和砷（As）影響DNA甲基化水平和模式以及組蛋白和轉(zhuǎn)錄本修飾，從而引起表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化。這些變化可能與金屬耐受性提高有關(guān)。例如，與更敏感但關(guān)系密切的植物物種擬南芥（Arabidopsis thaliana）相比，金屬超積累植物Noccaea caerulescens表現(xiàn)出更高的DNA甲基化水平和更低的DNA損傷。與親本品種相比，紅麻F1雜交種的差異甲基化模式和更高的金屬耐性得到驗證。此外，對擬南芥的研究表明，抑制DNA去甲基化過程可以增強(qiáng)對金屬的耐受性。
可能存在多種依賴于表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化的保護(hù)機(jī)制。首先，甲基化可能影響DNA對損傷的敏感性。甲基化沉默的擬南芥細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物表現(xiàn)出較高的單堿基替換（SBS）率。鹽脅迫進(jìn)一步增強(qiáng)了這一效應(yīng)。結(jié)果表明，DNA甲基化可能對突變具有保護(hù)作用。此外，還描述了組蛋白修飾與DNA損傷鑒定和修復(fù)之間的聯(lián)系。
其次研究表明，在金屬處理下差異甲基化的基因組區(qū)域包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因。在擬南芥中，VIM1蛋白的過表達(dá)導(dǎo)致NIP3啟動子區(qū)域的甲基化增強(qiáng)；1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)е缕浔磉_(dá)降低，阻礙As吸收，從而在As處理下增加生長參數(shù)。類似的甲基化依賴機(jī)制也可能在植物對其他金屬響應(yīng)中發(fā)揮作用。此外，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)可能受轉(zhuǎn)錄本甲基化調(diào)控。在大麥中，鎘處理導(dǎo)致編碼ABC和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因的高甲基化和同時誘導(dǎo)表達(dá)。
最后，DNA和RNA甲基化導(dǎo)致應(yīng)激信號和防御相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。WGBS分析揭示了植物對Cd、Pb、Al和Hg處理的數(shù)千個差異甲基化區(qū)域。在水稻中，大部分（近70%）的鎘敏感基因也存在差異甲基化。此外一些參與應(yīng)激響應(yīng)和解毒過程的基因，即編碼脂氧合酶（LOX）或谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST，GSTU 35）基因，其特征是甲基化和轉(zhuǎn)錄水平的Cd依賴性增加。另一項對水稻的研究表明，在Hg處理下，與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因在抗Hg系中低甲基化，而在易感系中高甲基化。在耐鎘性較高的紅麻雜種F1中，金屬暴露導(dǎo)致Nrf2.7基因甲基化程度降低，表達(dá)增強(qiáng)，Nrf2.7基因編碼的NRT1/PTR家族蛋白參與硝酸鹽、氨基酸和植物激素的轉(zhuǎn)運(yùn)。NPF2.7基因沉默導(dǎo)致對Cd響應(yīng)產(chǎn)生更大的生長抑制和氧化應(yīng)激增強(qiáng)，突出了其在植物金屬耐受中的重要作用。轉(zhuǎn)錄本甲基化模式的變化也可能影響基因的表達(dá)。在大麥中，m6A富集主要與較高的轉(zhuǎn)錄本豐度相關(guān)。鎘暴露導(dǎo)致WRKY和MYB家族的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和應(yīng)激相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄本甲基化，并伴隨其水平升高。在MAPK和過氧化物酶編碼基因中，在大多數(shù)情況下觀察到類似的模式，雖然在個別基因中表現(xiàn)出低甲基化和轉(zhuǎn)錄水平下降。另一方面，在大豆中，50%差異甲基化和表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出高甲基化和下調(diào)。高甲基化和下調(diào)的基因包括硫氧還蛋白過氧化物酶、過氧化物酶、多胺氧化酶以及與植物激素和鈣信號相關(guān)的基因。
重要的是，DNA甲基化和基因表達(dá)模式中的金屬依賴性變化可以遺傳給下一代，影響他們未來的應(yīng)激響應(yīng)。在水稻中，Hg處理的DNA甲基化模式至少部分地傳遞到S1和S2代。此外植物表現(xiàn)出基因表達(dá)的遺傳變化和對金屬的更高耐受性。
然而與耐受相關(guān)的DNA甲基化變化僅限于特定位點(diǎn)。整體的全基因組DNA甲基化變化可能是甲基化/去甲基化相關(guān)基因異常表達(dá)的結(jié)果。這種變化包括基因表達(dá)的巨大改變和植物功能失調(diào)。此外，推測DNA甲基化的整體調(diào)控可能引起基因組的穩(wěn)定性失調(diào)，并導(dǎo)致染色體重排。在人類中，甲基化的整體缺失與面部異常綜合征（ICF）發(fā)生有關(guān)。DNA甲基化變化也可在其他疾病中觀察到，包括癌癥、心血管疾病、II型糖尿病、狼瘡和精神分裂癥。因此，植物中金屬可能作為“毒甲基化（toxicomethylomic）”因子影響甲基化/去甲基化過程的基因表達(dá)。同時又會導(dǎo)致整體甲基化狀態(tài)變化、眾多基因表達(dá)失調(diào)，并影響基因組的穩(wěn)定性。
 
結(jié)論
大量文獻(xiàn)提供了非必需金屬和類金屬影響細(xì)胞DNA甲基化狀態(tài)的證據(jù)。然而DNA甲基化變化的確切模式取決于各種因素，包括植物種類、應(yīng)用處理的金屬、金屬濃度和處理持續(xù)時間。此外金屬敏感品系和耐受金屬品系之間，如在小黑麥或水稻中，甚至在親本和雜種F1之間，觀察到顯著差異（表1）。金屬對組蛋白修飾的影響研究相對較少，但對必需金屬的影響被證明在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控與組蛋白生物合成和修飾相關(guān)的基因的表達(dá)。因此，組蛋白修飾（甲基化和乙�；�）模式也受金屬調(diào)控。表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化是植物脅迫生物學(xué)領(lǐng)域中相對較新的研究方向。近期第一個表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)文獻(xiàn)報告結(jié)果表明，Cd暴露可調(diào)控大麥和大豆植株中轉(zhuǎn)錄本m6A甲基化的模式。Cd和Pb處理也會導(dǎo)致氧化依賴性RNA修飾8-羥基鳥苷（8-OHG）水平的早期增加，盡管8-OHG在金屬響應(yīng)中的作用仍有待闡明。表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化有助于增強(qiáng)植物對金屬的耐受性，例如通過保護(hù)DNA免受損傷、調(diào)控與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)、細(xì)胞信號和脅迫防御，從而阻礙金屬吸收和更有效的細(xì)胞間分布以及積累保護(hù)性化合物（例如黃酮類化合物）。
圖1總結(jié)了植物對金屬的表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)響應(yīng)。雖然在理解植物表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化對金屬（包括非必需金屬）響應(yīng)的作用方面取得了重大進(jìn)展，但仍有許多問題有待解決。


圖1：植物對金屬的表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)。
↑ - 水平增加，↓ -水平降低，m6A–腺苷在N6位甲基化，8-OHG – 8–羥基鳥苷。
暴露于金屬導(dǎo)致整體和位點(diǎn)特異性DNA甲基化水平變化，取決于植物物種、應(yīng)用的金屬、金屬濃度和處理持續(xù)時間。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動子區(qū)域甲基化增加導(dǎo)致其表達(dá)降低和金屬吸收減少。
DNA甲基化變化模式可遺傳給后代，可能與其增強(qiáng)的金屬耐受性有關(guān)。金屬暴露還會引起組蛋白修飾模式變化和RNA修飾水平的增加：m6A和8-OHG。這些變化的確切作用仍不清楚。然而，m6A增加和高豐度的甲基化轉(zhuǎn)錄本相關(guān)，如參與信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)運(yùn)和碳水化合物代謝。
 
首先，大多數(shù)情況下尚不清楚表觀遺傳變化是金屬毒性的癥狀還是與獲得應(yīng)激耐受相關(guān)的調(diào)控效應(yīng)。一方面，有假設(shè)指出特定區(qū)域或轉(zhuǎn)錄本的表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾參與信號和應(yīng)激防御網(wǎng)絡(luò)的激活。此外，研究表明，特定DNA區(qū)域甲基化影響轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)，并可能調(diào)控金屬吸收和細(xì)胞內(nèi)沉積。另一方面，與甲基化/去甲基化過程相關(guān)的基因表達(dá)中的金屬依賴性改變可能導(dǎo)致DNA甲基化水平的整體變化，從而導(dǎo)致基因表達(dá)的巨大變化。這將干擾正常的植物功能，并被視為毒性癥狀。此外，DNA甲基化水平的整體變化影響遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性，并可能導(dǎo)致其更易受到損害。表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾的有利或不利影響可能取決于一些內(nèi)部和外部因素，包括植物種類、發(fā)育階段、應(yīng)用的金屬類型和應(yīng)激強(qiáng)度。上述假設(shè)需要實驗支持。
其次，導(dǎo)致參與DNA甲基化/去甲基化過程的基因的控表達(dá)通路尚未闡明，盡管有假設(shè)指向ROS和RNS的作用。對美洲商陸（pokeweed）（Phytolaca americana）的一項研究表明，NADPH氧化酶抑制劑（ROS生成的主要成分）的應(yīng)用導(dǎo)致CMT2、CMT3、MET1和ROS1表達(dá)降低。RNS還可能對組蛋白修飾和DNA甲基化狀態(tài)發(fā)揮調(diào)控作用。例如，最近在馬鈴薯免疫中記錄了一氧化氮對調(diào)控DNA（去）甲基化基因的相關(guān)影響（與組蛋白甲基化對話）。在擬南芥中，一氧化氮通過抑制組蛋白去乙�；�酶活性在與應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)基因上誘導(dǎo)組蛋白高乙�；�得到驗證。
microRNAs（miRNAs）可以介導(dǎo)DNA甲基化。金屬在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、菜豆（Phaseolus vulgaris）、苜蓿（Medicago truncatula）、油菜（Brassica napus）、水稻（Oryza sativa）和煙草（Nicotiana tabacum）等多種植物中誘導(dǎo)miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。在金屬脅迫下，miRNA是參與金屬吸收和螯合、信號傳導(dǎo)、基因調(diào)控和解毒過程的調(diào)控因子。然而，這些RNA物種在金屬依賴性甲基化中的作用仍不清楚。這一領(lǐng)域需要進(jìn)一步探索，特別是考慮到miRNA在其他脅迫條件下可以調(diào)控DNA甲基化。在大麥中，干旱誘導(dǎo)的24mer靶向HvCKX2.1啟動子區(qū)，進(jìn)一步分析揭示了干旱導(dǎo)致HvCKX2.1甲基化增加，指出可能存在miRNA依賴性甲基化過程。
因此，需要開展更多的實驗工作以深入了解暴露于金屬的植物表觀遺傳和表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)修飾的機(jī)制和作用。這些結(jié)果可以通過調(diào)控表觀遺傳和/或表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)通路，或選擇具有特定表觀遺傳修飾模式的植物進(jìn)行進(jìn)一步育種，從而培育出更耐受的植物。

參考文獻(xiàn)：
Chmielowska-Bąk J, Searle IR, Wakai TN, Arasimowicz-Jelonek M. The role of epigenetic and epitranscriptomic modifications in plants exposed to non-essential metals. Front Plant Sci. 2023;14:1278185. doi: 10.3389/fpls.2023.1278185. PubMed PMID: 38111878.