cfDNA甲基化在器官和組織損傷檢測中的應用
檢測器官和組織損傷對于早期診斷、治療決策和監(jiān)測疾病進展至關重要。由于DNA甲基化模式可以響應組織損傷而改變，甲基化檢測提供了一種有前途的方法，在早篩早診、疾病進展監(jiān)測、治療效果和器官移植評估等可行性方面具有潛在應用。組織或器官損傷后釋放到血流中的cfDNA（cell-free DNA）可以作為損傷的生物標志物。cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)（包括DNA甲基化模式）可以提供對組織和器官損傷程度的見解。本文強調DNA甲基化作為一種廣泛研究的表觀遺傳修飾，在細胞生長、分化和疾病發(fā)展等過程中起著關鍵作用。介紹了多種高度精確的5-mC甲基化檢測技術，這些技術是獲得與組織損傷相關表觀遺傳改變的深刻見解的有力工具。深入研究了器官和組織損傷中DNA甲基化變化的潛在機制，包括炎癥、氧化應激和DNA損傷修復機制。介紹了cfDNA甲基化在檢測特定器官組織和器官損傷中的研究現狀。最后概述了在臨床試驗中鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標記中的多個步驟。本綜述將探討基于cfDNA甲基化的檢測器官和組織損傷的機制和研究現狀，潛在機制以及在臨床實踐中的潛在應用。
Introduction
檢測器官和組織損傷對于及時診斷和有效治療各種疾病和病癥至關重要。早期發(fā)現組織損傷可以及時干預，防止進一步的損傷并可能改善預后。監(jiān)測疾病進展也可以幫助告知治療決策，并根據需要進行調整。此外，評估治療效果可以幫助確定干預措施是否有效，并為繼續(xù)或修改治療計劃的決定提供信息。最后，在移植醫(yī)學中，檢測組織損傷對于評估移植器官的生存能力和確保受體成功結果至關重要。在此前研究中，組織切片的組織病理學檢查通常被認為是檢測組織和器官損傷的“金標準”。然而，這種方法是高度侵入性的，不適用于組織和器官損傷的早期篩查。
CpG位點是DNA上的特定區(qū)域，以C（胞嘧啶）和鳥嘌呤核苷酸命名，通過磷酸二酯鍵連接。這些位點廣泛分布于整個人類基因組中，對基因表達和基因組穩(wěn)定性至關重要。在許多研究中，CpG位點甲基化狀態(tài)與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。DNA甲基化也因組織損傷而變化�；诩谆臋z測為檢測器官和組織損傷提供了一種有前途的方法�；贒NA甲基化模式的表觀遺傳分析包括DNA甲基化模式的研究，以檢測可能反映組織損傷或疾病相關變化的跡象。這些測試方法具有高度的特異性和靈敏度，可應用于各種樣本類型，包括血液、尿液和組織活檢，促進非侵入性數據收集，并大大推進組織損傷的早期診斷。基于甲基化的檢測方法正在研究一系列應用，從早期發(fā)現和監(jiān)測疾病進展到評估治療效果和評估移植器官活力。
液體活檢，特別是血漿中循環(huán)cfDNA甲基化分析，可能成為組織損傷檢測中一種有前途的非侵入性診斷方法。血液或體液樣本的收集是一種非侵入性程序，不需要組織切除或組織活檢，從而避免了傳統(tǒng)組織檢查的痛苦和風險。大多數cfDNA片段的范圍為80-200 bp，長度對應于核小體大小160-180 bp。起源組織解卷積是cfDNA甲基化分析中的關鍵技術，使研究人員能夠根據DNA甲基化模式確定cfDNA來源。該技術基于一個核心概念：不同的組織和器官在其DNA甲基化譜中具有獨特的表觀遺傳特征。因此，當這些組織或器官受損時，例如由于癌癥、創(chuàng)傷或其他導致細胞死亡的疾病，它們會將cfDNA釋放到血液中（圖1A）。研究人員可以分析這些cfDNA樣本中的DNA甲基化模式，并嘗試將其與已知組織特異性DNA甲基化模式的參考數據庫進行比較。通過這種比較，他們可以解卷積或確定給定cfDNA樣品來源組織或器官。這項技術的優(yōu)點是能夠以非侵入性方式檢測和監(jiān)測組織特異性損傷，而不需要傳統(tǒng)的組織活檢。
如圖1B所示，組織和器官損傷后cfDNA形式的表觀遺傳標記物釋放到血流中，使cfDNA成為評估組織和器官損傷的有價值的生物標志物。此外，cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)，包括DNA高甲基化和低甲基化模式，可以提供對組織和器官損傷程度的見解�？傮w而言，cfDNA的DNA甲基化狀態(tài)可用作組織和器官損傷的生物標志物。本文將研究cfDNA甲基化涉及的潛在機制，用于檢測器官和組織損傷的cfDNA甲基化模式的當前研究現狀，以及這些檢測在臨床實踐中的潛在應用。
表觀遺傳學和DNA甲基化
即使DNA序列保持不變，真核基因表達也通過多種機制受復雜調控，這種現象被稱為表觀遺傳學。表觀遺傳調控涉及多種機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。其中DNA甲基化研究非常廣泛。
在真核生物中，DNA甲基化涉及在DNA甲基轉移酶的催化下，在DNA中C的第5個碳上添加一個甲基，產生了5-mC（5-甲基胞嘧啶），主要位于CpG位點。人類基因組中約有2.8M的CpG位點，但其分布并不均勻。CpG序列平均僅發(fā)生約1%，CGI（CpG島）是密集的區(qū)域，其頻率是平均頻率的五倍以上，通常定義為超過200個堿基對長的基因組區(qū)域，GC含量超過50%，CpG比率超過60%。超過60%的基因，包括具有組織特異性表達模式的基因，在其啟動子區(qū)域和第一外顯子中具有CpG島。
在正常組織基因組中，約70%的CpG位點被甲基化，而大多數CpG島未甲基化。一些CGI基因被甲基化，如非活性X染色體上的基因和印跡基因。甲基化在各種生物過程中起著至關重要的作用，包括細胞生長、分化、X染色體失活、基因組印跡、基因沉默、防御外源基因以及多細胞生物中的異生素代謝。
表觀遺傳機制的研究在科學研究和醫(yī)學中具有巨大意義，增強了對基因調控、疾病發(fā)生和遺傳以及創(chuàng)新療法發(fā)展的理解。
DNA甲基化在器官和組織損傷中的變化機制
DNA甲基轉移酶（DNMTs）是一類在細胞中起關鍵作用的酶，可以調控DNA甲基化。DNMT主要負責向DNA中的胞嘧啶殘基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，從而實現DNA甲基化。DNMT能夠與DNA結合并識別靶DNA序列，通常是CpG。一旦DNMT與靶DNA序列結合，它們就會將甲基從SAM供體轉移到DNA中的胞嘧啶堿基。該過程涉及形成共價鍵，將甲基添加到胞嘧啶堿基的第五個碳原子上，產生5-mC。DNMT1（DNA甲基轉移酶-1）作為維持DNMT，主要任務是在DNA復制和細胞分裂過程中維持DNA甲基化穩(wěn)定性。DNMT1可以識別新合成的未甲基化DNA鏈，并在DNA復制過程中添加甲基，以確保每一代細胞中DNA甲基化模式的正確遺傳。
DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，負責在細胞分化和發(fā)育過程中引入新的DNA甲基化。這些酶可以將甲基引入特定基因或基因組區(qū)域，從而調控基因表達并影響細胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化動態(tài)平衡的關鍵組成部分。TET酶可以從DNA中去除甲基，將5-mC轉化為5hmC（5-羥甲基胞嘧啶），并參與DNA去甲基化過程。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化誘導的胞嘧啶脫氨酶）和AB（Apobec）是脫氨酶，通常與DNA堿基脫氨和脫氧核糖修飾有關，而不是直接參與DNA甲基化或去甲基化反應。它們在改變DNA堿基方面起作用，例如將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而不涉及DNA甲基的添加或去除。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是與DNA修復相關的兩種酶，在維持DNA堿基的完整性和糾正DNA堿基錯誤方面起著至關重要的作用。這些酶向DNA分子引入脫氨或脫氧核糖基化等變化，影響DNA甲基化狀態(tài)。組織和器官損傷可以通過各種機制調控DNMT和DNA去甲基化酶，從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應激和DNA損傷修復機制。這些機制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的復雜變化，并導致?lián)p傷和疾病的持續(xù)（圖2）。
圖2：器官和組織損傷中的DNA甲基化和去甲基化機制。組織和器官損傷可以通過各種機制調控DNMT和DNA去甲基化酶（如TET和TDG），從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應激和DNA損傷修復機制
炎癥
在組織和器官損傷后，身體啟動炎癥反應以清除受損的細胞和組織，促進修復和再生。然而，這種炎癥反應也可能導致DNA甲基化變化，因為炎癥反應可以產生活性氧（ROS），亞硝酸鹽和其他可能直接或間接影響DNA甲基化的有害物質。炎癥還可以激活免疫細胞，導致細胞因子和其他信號分子的分泌，從而改變DNA甲基化模式。例如，IL-6（細胞因子白細胞介素-6）和STAT3（信號轉導和轉錄激活因子3）已被證明可增加DNMT活性，從而導致某些基因的DNA甲基化增加。過量的IL-15（細胞因子白細胞介素-15）在動物模型中誘導DNMT3b（DNA甲基轉移酶-3b）上調和整體DNA高甲基化。
氧化應激
由于受損細胞釋放的自由基、過氧化物和其他氧化劑，組織和器官損傷可能會增加細胞氧化應激，可能會破壞DNA并改變調控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化應激可導致DNMT氧化，導致活性改變和DNA甲基化模式改變。在最近對Graves病患者外周血單核細胞的研究中，發(fā)現活性氧增加導致DNMT1表達增加，反過來又與促進Graves病自身免疫的免疫調控基因異常甲基化模式有關。類似地，在多柔比星誘導的心臟毒性的研究中，多柔比星誘導心臟細胞損傷和氧化應激，其產生自由基和一氧化氮以響應應激。氧化應激增加并下調DNMT1酶活性，導致DNA甲基化的線粒體功能障礙。氧化應激還可以改變從DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，從而導致DNA甲基化模式變化。在多囊卵巢綜合征疾病研究中構建的細胞損傷模型中，發(fā)現細胞損傷降低了TET水平并導致細胞甲基化水平升高。
DNA損傷修復
DNA損傷是組織和器官損傷的常見后果，DNA修復機制被激活以修復損傷。DNA修復過程可以影響DNA甲基化模式，因為一些DNA修復酶可以改變DNA甲基化水平。例如，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一種參與DNA修復、染色質重塑和基因表達的核酶（nuclear enzyme），可以催化甲基全基因組染色質去除。PARP1與染色質全基因組的結合與DNA甲基化模式互斥，表明PARP1與DNA甲基化之間存在功能互作。事實上，抑制PARylation會導致DNA甲基化模式的全基因組變化。DNA雙加氧酶AlkB也可以調控DNA甲基化水平，AlkB可以通過在Fe（II）離子，α-KG和氧氣存在下的氧化去甲基化機制將m3C和m1A直接轉化為未甲基化堿基。在一項血液疾病研究中，生發(fā)中心的B細胞在DNMT1幫助下分化，改變其DNA模式以正確分化。DNMT1在DNA甲基化和雙鏈斷裂修復中發(fā)揮雙重作用。
總之，組織和器官損傷可以通過多種機制引起DNA甲基化模式變化，這些機制可以互作以產生DNA甲基化模式的復雜變化。
5-mC甲基化檢測技術
研究人員利用各種DNA甲基化檢測方法研究cfDNA中的甲基化，從而了解健康和疾病狀態(tài)下的甲基化變化。這些方法主要包括一系列5-mC甲基化檢測，可分為以下幾類：
非測序的甲基化檢測方法
非測序甲基化檢測方法通常不涉及DNA測序，而是依賴各種化學或生物技術來分析DNA甲基化狀態(tài)。這些方法包括限制性酶消化，包括使用甲基化敏感酶在特定核苷酸序列切割DNA，從而可以研究DNA甲基化。例如，von Kanel等人結合限制性內切酶消化和實時PCR或Xianfeng Wang等人基于CRISPR/Cas13a的策略等方法能夠精確評估單個位點的甲基化狀態(tài)和拷貝數變化。此外，MSP（甲基化特異性PCR）和其他使用亞硫酸鹽處理的DNA模板的基于PCR的方法是分析特定位點DNA甲基化的靈敏和特異性技術，MSP使用甲基化特異性引物選擇性擴增甲基化或未甲基化的DNA序列。這些方法，包括TaqMan實時FQ-MSP（TaqMan實時甲基化特異性PCR）和ddPCR（數字液滴PCR），提供了高精度和靈敏度，使其成為研究DNA甲基化的有價值的工具。例如，MSP聯(lián)合ddPCR已被用于檢測原發(fā)性硬化性膽管炎患者的膽管癌標志物。此外，HRM（高分辨率熔解）是一種基于甲基化和非甲基化DNA片段的不同熔解行為檢測DNA甲基化的方法。HRM允許對DNA甲基化進行定性和定量分析，而不需要昂貴的測序技術，從而提供了一種廣泛用于DNA甲基化研究的快速，高通量和經濟高效的方法。Wojdacz和Dobrovic的MS-HRM（甲基化靈敏的高分辨率熔解）方案可以檢測未甲基化中的甲基化panel，其靈敏度與MSP相當。Lasse Kristensen等人還開發(fā)了一種無探針定量MSP分析方法，使用HRM分析進行可靠檢測，即使在0.1%甲基化標準下也是如此。此外，甲基化芯片如Illumina的HM450K（Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip）和850K（Illumina Infinium methylation EPIC Bead Chip）為全面的甲基化分析提供了具有成本效益和高通量的平臺，HM450K靶向人類基因組中超過485000個胞嘧啶位點，并被廣泛用于癌癥研究。較新的850K芯片擴展了覆蓋范圍，包括針對調控區(qū)的其他探針，但這些陣列的全基因組覆蓋范圍有限，可能無法捕獲所有甲基化信息�，F已更新至935k芯片。
測序的甲基化檢測方法
基于測序的DNA甲基化檢測方法包括一系列用于研究DNA甲基化模式的技術。一種廣泛使用的方法是BSP（亞硫酸鹽測序PCR），它將PCR擴增與Sanger測序相結合，以鑒定單個CpG位點的甲基化位點。BSP有兩種形式：直接BSP，它直接對PCR產物進行測序，克隆BSP，它涉及將PCR產物克隆到載體中進行測序。然而BSP具有局限性，例如對低水平鑲嵌的靈敏度和潛在的PCR誘導的偏倚。
焦磷酸測序通過定量檢測核苷酸的摻入來實時高分辨率和靈敏地監(jiān)測DNA甲基化，這對于各種研究和臨床應用都很有價值，包括癌癥預測和重復元素研究。
WGBS（全基因組重亞硫酸鹽測序）提供了全面和高分辨率的全基因組甲基化信息，是甲基化檢測的“金標準”，但它面臨著復雜的數據處理和高測序要求等挑戰(zhàn)。另一方面，MCTA-seq（甲基化CpG串聯(lián)擴增和測序）是一種靈敏的方法，能夠分析微小的基因組DNA量（低至7.5 pg），有望用于非侵襲性癌癥篩查。然而，與全基因組方法相比，它可能需要專門的設備，且覆蓋范圍有限。
靶向亞硫酸鹽測序（Target-seq）選擇性地擴增特定的基因組區(qū)域，將甲基化陣列的成本效益與亞硫酸鹽測序的數字信號相結合。可以針對特定的基因或區(qū)域進行定制，但可能需要額外的時間和資源來進行探針設計和合成。
RRBS（減少代表性亞硫酸鹽測序）是一種經濟有效的方法，專注于CpG富集區(qū)域，并實現了scRRBS（單細胞RRBS）等進步，為腫瘤負荷估計和疾病生物標志物發(fā)現提供了見識。
MeDIP-Seq（甲基化DNA免疫沉淀測序）減少了甲基化測序所需的DNA input，使其適用于cfDNA甲基化檢測。該方法的擴展cfMeDIP-seq（cfDNA甲基化DNA免疫沉淀和高通量測序）可應用于DNA可用性有限的各種樣品類型，可能將其應用擴展到癌癥檢測之外。
MBD-Seq（CpG甲基化結合結構域富集測序）使用MBD（甲基CpG結合結構域）蛋白選擇性捕獲甲基化DNA片段，有效鑒定和定量甲基化區(qū)域，特別是CpG和CGI富集區(qū)域。超低 input cfDNA甲基化分析方法cfMBD-seq（cfDNA-MBD-seq）優(yōu)化了用于各種樣品類型的MBD捕獲條件。
納米孔測序是一種革命性的技術，可直接檢測DNA分子通過納米孔時的電流變化，從而實現直接甲基化檢測，而無需化學修飾。例如ONT（牛津納米孔技術）具有高通量、高分辨率和單分子測序等優(yōu)點，在包括癌癥檢測在內的各種研究和臨床應用中具有重要價值。然而它有局限性，包括單核苷酸變異和插入/缺失的每堿基成本和錯誤率較高。
基于SMRT（單分子實時）技術的PacBio測序產生異常長的DNA讀長，使其適用于研究復雜的基因組，結構變異，重復序列和重復元件的表觀遺傳變化。可以在沒有GC或AT含量偏好的情況下分析不同的基因組和DNA樣品。
cfDNA甲基化檢測特異性組織及器官損傷的研究現狀
基于cfDNA甲基化的檢測在檢測組織和器官損傷方面具有巨大潛力，該領域的進一步研究可以為各種組織和器官疾病提供新的診斷和預后工具。以下描述了cfDNA甲基化在檢測特定器官組織和器官損傷中的研究現狀（表1）。
表1：特定組織和器官損傷的cfDNA甲基化標記
肝臟
基于肝源性cfDNA甲基化檢測方法已被用于檢測各種情況下的肝損傷，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝、肝細胞癌和肝移植。Miguel Waterhouse等人使用數字液滴PCR檢測cfDNA中PTK28基因特異性甲基化標記，以檢測急性移植物抗宿主病患者的肝組織損傷。區(qū)分肝臟中aGvHD（急性移植物抗宿主�。┖头莂GvHD（非急性移植物抗宿主病）的閾值為1.5（靈敏度=0.928；特異性=0.910），肝損傷aGvHD的臨床改善導致甲基化PTK2B濃度降低。在另一項關于癌癥對宿主組織損害的研究中，發(fā)現受癌癥影響的器官中細胞死亡可以通過cfDNA組織特異性甲基化模式來檢測。在肝細胞癌研究中，通過Illumina Infinium 450k芯片鑒定了三種肝組織甲基化特異性標志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。與健康供體、局部癌癥患者或非肝轉移性疾病患者相比，肝轉移患者表現出更高水平的肝細胞來源cfDNA，無論是通過肝細胞來源cfDNA比例或每毫升肝細胞基因組當量來檢測。使用561（基因組當量/mL）的肝源性特異性cfDNA標記物，檢測肝轉移和肝損傷的特異性和靈敏度分別為95%和35%。此外，肝細胞cfDNA水平能夠區(qū)分有無肝轉移的4期癌癥患者（AUC=0.81，95%置信區(qū)間0.73-0.89，P<0.0001）。另一項研究描述了一種通過基于攜帶肝細胞特異性甲基化模式的cfDNA片段的定量鑒定肝細胞中特異性非甲基化的三個基因組位點（ITIH4，IGF2R和VTN）來檢測急性肝細胞死亡的方法。通過ddPCR分析了來自健康個體、肝移植患者、肝臟供體、敗血癥患者和杜興氏肌營養(yǎng)不良癥的血液樣本，結果表明，這三種肝細胞來源的cfDNA分析可以提供有關肝細胞死亡的特定和敏感信息。它提供了肝損傷的近實時指示，并可以動態(tài)監(jiān)測肝損傷。
腎臟
基于甲基化的檢測方法已越來越多地用于檢測腎臟損傷并了解與腎臟疾病相關的潛在分子機制。在腎臟患者中觀察到特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了健康對照組和急性腎損傷患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因啟動子區(qū)四個位點的甲基化狀態(tài)。結果表明，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因啟動子在全基因組模式中高于健康對照組（P<0.0001），表明KLK1基因甲基化有可能成為監(jiān)測腎損傷的標志物。在另一項研究中，手術后第二天，通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測到13名死者和10名活體腎移植受者以及65名健康對照者尿液DNA中兩個基因啟動子（DAPK和CALCA）的異常甲基化，移植受者尿液中發(fā)現CALCA基因啟動子異常甲基化的可能性明顯高于健康對照組（100%比31%；P<0.0001）。與活體供體移植相比，死亡患者尿液中鈣質高甲基化增加（21.60） ± 12.5比12.19 ± 4.7條；P = 0.04）。此外，與急性排斥反應和緩慢或快速移植功能相比，活檢證實的急性腎小管壞死患者的尿鈣異常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9、13.87±6.49、17.17±13.4；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7；P=0.5）。這些結果表明，尿DAPK和CALCA基因表觀遺傳學是一種有前途的急性缺血性損傷生物標志物腎移植方法。在一項針對腎移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA，以了解感染與腎組織損傷之間的關系。結果顯示，移植后組織特異性cfDNA尿液絕對濃度由于應激損傷而增加，但在沒有感染的10天后恢復到基線。腎病合并BK病毒感染患者的腎源性cfDNA水平顯著高于正常人和單純BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）。此外，細菌感染患者的膀胱和白細胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染與組織損傷之間可能存在相關性。cfDNA片段大小譜可以提供一個指標，通過該指標可以對具有不同感染癥狀的患者進行分層。這些發(fā)現表明，分析cfDNA水平可以提高我們對感染相關腎損傷的理解，并可能導致更好的診斷工具和治療方法。
心臟
基于cfDNA甲基化的檢測已被用于檢測各種情況下的心臟損傷，包括心臟直視手術和MI（心肌梗塞）。一項新的研究評估了cfDNA分子的六個非甲基化位點作為心臟直視手術后心臟損傷的標志物。使用六種心肌細胞特異性DNA非甲基化標記物檢測42名接受心臟直視手術的嬰兒血漿中的心臟cfDNA。手術后心臟cfDNA升高，反映了與手術直接相關的組織損傷，大多數患者術后cfDNA降低。本研究還使用心臟cfDNA水平來預測手術結果，選擇機械通氣持續(xù)時間（大于或小于24小時）和最大VIS（大于或小于20小時），并使用ROC（接受者操作特征）曲線作為臨床結果。作為機械通氣持續(xù)時間或最大VIS的預測指標，術后6小時心臟cfDNA的AUC分別為0.7475和0.7555。類似地，在另一項研究中鑒定出心肌細胞甲基化標記物（FAM101A）。ddPCR用于檢測完全未甲基化的FAM101A的血漿cfDNA濃度，其可以靈敏且特異性地檢測心肌細胞損傷。膿毒癥患者的臨床觀察表明，心臟cfDNA水平不受腎臟或肝臟損傷的顯著影響。Jie Ren等人發(fā)現，當心肌損傷發(fā)生時，cfDNA被釋放并鑒定出位于CORO6、CACNA1C（兩個位點）、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六個CGCGCGG位點，顯示出心臟特異性高甲基化模式。在這些標記物中，CORO6在心臟中顯示出最特異性甲基化模式。繼續(xù)研究針對該特定位點的ddPCR測定法的開發(fā)，該測定法有效地檢測了MI患者入院時cfDNA中心臟損傷的信號。
肺
基于肺器官特異性cfDNA甲基化檢測已被用于檢測各種情況下的肺損傷，包括慢性阻塞性肺病、肺癌、肺結節(jié)和支氣管檢查后。在2022年的研究中鑒定了17個具有肺特異性甲基化模式位點的甲基化狀態(tài)，并將其用于評估健康志愿者和肺部疾病患者血漿中肺源性cfDNA。結果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化標記允許對肺源性cfDNA進行突變獨立、靈敏和特異性檢測，從而報告正在進行的肺損傷。Wenhua Liang等人開發(fā)了一種新的非侵入性診斷方法，該方法基于肺損傷釋放的cfDNA甲基化分析中的9種標志物來檢測早期肺癌并將肺癌與良性肺結節(jié)區(qū)分開，該模型特異性達到93.2%。這九個標記是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667、cg04175417、cg21962423、cg23156742、cg06287318、cg21963643、cg07568344和cg12545252。
腦
在2022年探索側支組織損傷的液體活檢研究中，還鑒定了10個基因組位點，這些位點在神經元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）、少突膠質細胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形膠質細胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化。來自每種腦細胞類型的信號產生ROC曲線，每種腦細胞類型的標志物都能夠識別腦轉移患者的血漿，AUC為0.72-0.81，神經元標志物的95%特異性、靈敏度為17.2%，星形膠質細胞標志物的95%特異性、靈敏度為13.8%。
胰腺
甲基化組織研究已經能夠在器官中定位特定細胞類型，并且可以通過cfDNA甲基化分析檢測細胞損傷。例如，在血漿胰腺β細胞特異性cfDNA的研究中，發(fā)現70%的β細胞中有六種特異性生物標志物（Fbxl19、Mtg1、Leng8、Zc3h3、INS、INS反義）完全未甲基化，其余30%表現出一個或兩個CpG位點甲基化。該研究發(fā)現胰島移植后胰島β細胞中cfDNA甲基化標志物顯著升高，反映了β細胞的損傷和死亡。此外，鑒于β細胞中未甲基化INS-CpG位點頻率增加，細胞死亡后釋放到循環(huán)中的未甲基化與甲基化INS-DNA比例反映了β細胞死亡。一項研究在編碼PRMT1染色質靶標（CHTOP）的基因內鑒定了一個基因內CpG位點，該位點對INS具有互補的組織特異性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年檢測胰島損傷的信心。兩種未甲基化生物標志物組合的特異性高達100%。
肌肉
肌萎縮側索硬化癥（ALS）是一種進行性神經退行性疾病，可導致上運動神經元和下運動神經元死亡。目前，尚無確定的ALS循環(huán)生物標志物。因此，很難監(jiān)測疾病進展并有效評估治療反應。cfDNA提供了一個檢測ALS細胞死亡的機會，填補這些空白。在一項研究中，從20名ALS患者和20名對照中分離出血漿cfDNA，與對照組相比，cfDNA用于鑒定ALS患者RHBDF2基因中的新型差異甲基化標記。該研究進行了ROC分析，以確定RHBDF2基因ALS的診斷效果。其中，RHBDF2基因具有兩個增強子區(qū)域，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC為0.724（CI 0.559-0.888；P=0.017），CpG2的AUC為0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）。區(qū)分ALS患者和對照組的最佳閾值為CpG1的65.97%（靈敏度=0.850，特異性=0.526）和CpG2的83.26%（靈敏度=0.800，特異性=0.474）。在現有研究中，針對甲基化cfDNA開發(fā)了一種高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通過期望最大化進行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS參考數據，允許低覆蓋率和噪聲數據。在該研究中，使用CelFiE從ALS患者和年齡匹配的對照中檢測到cfDNA。ALS和對照中cfDNA的總體豐度顯示出顯著差異。ALS組（n=28，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和對照組（n=25，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎縮側索硬化組（ALS組）骨骼肌比例估計值與對照組相比有顯著性差異（P=5.02×10-2）�？傊�，這些結果表明cfDNA是鑒定肌肉萎縮和死亡的第一個定量生物標志物的有希望的方向，這是ALS的標志。
總的來說，人們對使用基于甲基化檢測方法來檢測器官和組織損傷的跡象越來越感興趣，并且在各種情況下發(fā)現了許多有希望的標記物（圖3）。然而，需要進一步的研究來驗證這些組織特異性甲基化標記，并開發(fā)有效的臨床診斷和預后工具。
圖3：在先前的研究中，已經在組織和器官損傷中發(fā)現了cfDNA甲基化的生物標志物。這些生物標志物10個與大腦有關，9個與肺有關，6個與心臟有關，7個與肝臟有關，3個與腎臟有關，7個與胰腺有關，1個與肌肉有關
從組織器官損傷特異性cfDNA甲基化標志物鑒定到臨床檢測路徑
基于甲基化的損傷檢測依賴于組織和器官損傷后DNA甲基化模式變化。甲基化模式對于每種細胞類型都是特異性的，在同一個體內部和同一細胞類型中保守，并且在生理或病理條件下高度穩(wěn)定。因此有可能利用與組織和器官損傷相關的特定cfDNA甲基化模式來鑒定起源組織并推斷組織和器官損傷的程度。鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標記及其在臨床檢測中的應用需要多步驟方法。然而，鑒于新生物標志物的不斷發(fā)現和提出，建立一個強大的生物標志物驗證和認證系統(tǒng)以確保廣泛接受和正確使用成為當務之急。遵循生物標志物認證的各種原則，推斷鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標志物并將其應用于臨床檢測過程可能需要幾個不同的階段，如圖4所示。值得注意的是，利用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于早期研究階段。到目前為止，還沒有進行臨床研究，也沒有將商業(yè)產品引入臨床環(huán)境。
圖4：cfDNA甲基化檢測組織器官損傷的發(fā)展路徑。該路徑概述了將潛在標志物轉化為診斷和監(jiān)測組織和器官損傷的臨床有用工具所必需的研究和開發(fā)進展
鑒定和驗證潛在的甲基化標記
美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對生物標志物的使用設定了四個類別：預后性、預測性、反應指示性和療效反應性（表2）。首先，通過進行文獻綜述，并確定與組織和器官損傷相關的潛在甲基化標志物。這可以通過響應損傷的甲基化變化的研究或者已經鑒定與健康組織相比患病組織中的DMR（差異甲基化區(qū)域）的研究來完成。例如在肝損傷生物標志物的研究中，通過檢查WGBS數據并鑒定差異甲基化或差異非甲基化區(qū)域來選擇肝細胞特異性CpG位點。為了選擇高甲基化標記，確定了肝細胞樣品的75th百分位數和所有非肝細胞樣本的5th百分位數之間差異超過0.5的區(qū)域。對于低甲基化標記物，需要在95th和20th百分位數之間有0.5的差異。通過這種方式，總共篩選出三種肝細胞標志物（cg02396797、cg030646442、cg21178851）。甲基化DNA數據庫是研究與組織損傷相關的DNA甲基化模式的寶貴資源。這些數據庫可用于鑒定生物標志物、理解分子機制、評估嚴重程度、監(jiān)測治療反應以及研究環(huán)境和生活方式因素。數據庫包括參考序列數據庫、癌癥相關數據庫和疾病相關數據庫（表3）。這些數據庫為有興趣鑒定與組織和器官損傷相關的甲基化標記的研究人員提供了寶貴的資源。
表2：FDA生物標志物分類
表3：常見DNA甲基化數據庫的內容和網站
建立檢測分析
一旦確定了潛在的甲基化標記，就需要開發(fā)一種甲基化檢測方法，可以準確檢測這些標記中的甲基化變化。根據所分析的特定標記，檢測方法可以基于不同的技術，例如MSP（甲基化特異性PCR）、焦磷酸測序（pyrosequencing）、WGBS（全基因組甲基化測序）或DNA甲基化芯片。設計分析方法后，需要優(yōu)化檢測參數，包括優(yōu)化引物設計、退火溫度（annealing temperature）、循環(huán)條件和檢測方法等檢測參數，以確保準確可靠地檢測已鑒定標記中的甲基化變化。
例如Miguel Waterhouse開發(fā)了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化測定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的組織損傷。同樣Tulsi K.Mehta等人設計了特異性擴增CALCA基因的引物和探針，以開發(fā)一種qPCR（定量PCR）檢測方法，該方法有望用于評估移植環(huán)境中的急性腎損傷。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了KLK1基因的四個連續(xù)CpG甲基化，位于轉錄起始位點上游-203bp至-135bp之間。在cfDNA甲基化研究中，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序來檢測cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化狀態(tài)，其中甲基化敏感的TaqMan探針用于分析亞硫酸氫鹽處理的cfDNA。探針的有限長度（最多30 bp）決定了它們只能覆蓋2-4個提供信息的CpG位點。IGF2R位點覆蓋了四個CpG。VTN位點的探針中只覆蓋兩個CpGs ，預測非肝組織DNA中相對較高的噪聲頻率（陽性液滴）。設計了兩個TaqMan探針以提高特異性，每個探針都從VTN位點相同擴增的100 bp片段中鑒定出不同嘧啶簇（每個簇包含兩個CpG位點）中的甲基化缺失，并且每個探針都用不同的熒光團標記。
分析有效性
分析有效性是驗證檢測方法的一個重要方面，該檢測方法評估所開發(fā)測定的準確性和可靠性，包括精確度、靈敏度和特異性。為了確保所開發(fā)的甲基化檢測方法的分析有效性，應采取以下步驟：
精確度評估：使用已知甲基化狀態(tài)的對照樣品，評估檢測方法的精確度。通過分析重復樣品來計算內部精確度和外部精確度，以確定方法的精確度。
靈敏度評估：使用已知甲基化水平較低或甲基化變化較小的樣品，評估檢測方法的靈敏度。評估該方法準確檢測微小甲基化變化的能力。
特異性評估：使用具有不同甲基化模式或來自不同來源的樣品，評估檢測方法的特異性。確定該方法準確檢測甲基化變化而無假陽性的能力。
使用具有已知甲基化狀態(tài)的對照樣品驗證開發(fā)的測定法有助于建立檢測方法的準確性和靈敏度。這有助于評估該方法在甲基化檢測中的性能，并為其臨床應用提供可靠的基礎。
臨床有效性
在建立分析有效性后，會啟動臨床研究以建立臨床有效性：證明生物標志物和檢測方法適合特定使用背景的目的，即分析結果將為醫(yī)療決策提供信息。應使用臨床樣品評估所開發(fā)檢測方法的臨床有效性，例如從具有特定組織或器官損傷的患者獲得的血液或組織樣品。該驗證過程旨在確定該測定是否可以有效區(qū)分有損傷和無損傷患者，并評估損傷個體的臨床靈敏度、臨床特異性和檢出率。臨床靈敏度是指測定正確鑒定具有特定組織或器官損傷的個體的能力，而臨床特異性是指測定正確識別沒有損傷的個體的能力。應評估該測定的靈敏度和特異性，以確定其在臨床環(huán)境中的準確性。此外，應評估受傷個體的檢出率，這反映了臨床診斷為受傷的患者中陽性結果的比例。這些信息可以幫助評估檢測方法在檢測預期患者群體中特定組織或器官損傷方面的性能。
例如，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化檢測方法在28名急性移植物抗宿主�。╝GvHD）患者和11名無相關癥狀的患者中進行了臨床驗證，區(qū)分肝臟aGvHD與非aGvHD的最佳閾值為1.5（logPTK2拷貝/mL血漿；靈敏度：0.928；特異性：0.910）。同樣，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供體、85名局部癌癥（非肝臟）患者、55名非肝臟轉移性癌癥患者和63名有肝臟轉移的癌癥患者，以驗證基于cfDNA PCR測序分析的檢測方法在區(qū)分肝臟轉移方面的表現。結果表明，通過這種方法檢測到的肝細胞的AUC濃度為0.81（95%置信區(qū)間=0.74–0.87，P= 0.0001）。肝臟轉移檢測的特異性和靈敏度分別為95%和35%。
臨床效用
臨床效用是指在考慮PPV（陽性預測值）、NVP（陰性預測值）和成本等因素下，評估患者檢測中開發(fā)的檢測方法的成本效益。臨床效用的評估可以考慮多種因素，包括但不限于以下因素。
診斷準確性：評估甲基化檢測方法在正確鑒定患者組織或器官損傷方面的靈敏度、特異性、PPV和NPV。臨床影響：評估甲基化檢測方法對治療決策和患者管理的影響，例如它是否有助于選擇適當的治療選項、監(jiān)測治療反應或預測疾病復發(fā)。
成本效益：考慮與甲基化檢測過程相關的成本，包括樣本收集、實驗室檢測、數據分析和結果解釋，并將其與潛在的益處進行權衡，如改善患者結果、降低醫(yī)療保健成本和提高患者滿意度。
可行性和可擴展性：評估在臨床環(huán)境中實施甲基化檢測方法的實際可行性，包括樣本收集的便利性、所需的實驗室基礎設施和專業(yè)知識，以及擴展到更大患者人群的可擴展性。
比較效果：在準確性、臨床影響和成本效益方面，將甲基化檢測方法與現有的標準診斷方法或替代方法進行比較。
倫理和法律考慮：在評估臨床效用時，考慮倫理和法律考慮因素，如患者隱私、知情同意和遵守監(jiān)管要求。
總之，鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標記物，并將其應用于臨床檢測，需要一種嚴格和系統(tǒng)的方法，涉及多個研究、驗證和檢測階段。然而，值得注意的是，目前使用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于研究的早期階段，迄今為止，尚未進行臨床研究，也未在臨床環(huán)境中實施任何商業(yè)產品。
研究人員、臨床醫(yī)生和行業(yè)伙伴之間的合作對于確保基于甲基化的診斷檢測方法的成功開發(fā)和臨床應用非常必要。
挑戰(zhàn)和未來方向
結合之前的討論，研究甲基化標記物在組織和器官損傷中的應用存在一些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)和未來的研究方向包括：
個體之間甲基化模式的變異性
根據之前的大量研究，DNA甲基化模式在個體之間差異很大，并且與性別、生活環(huán)境和許多其他因素有關。因此，在臨床上使用DNA甲基化分析來檢測組織損傷仍然存在許多困難。這一挑戰(zhàn)的一個潛在解決方案是使用大規(guī)模研究來確定跨人群一致的甲基化模式，而不是依賴于單個標記。這種方法可以幫助鑒定不同個體之間常見的甲基化模式，并且可以用作鑒定與不同組織或器官相關的甲基化變化的參考。通過鑒定這些常見模式，研究人員可以減少個體變異性的影響，提高甲基化分析的準確性。另一種方法包括利用機器學習算法來辨別特定類型組織損傷所特有的甲基化模式。這種方法不再僅僅依賴于可能受個體變異性影響的個體標記，而是側重于能夠提供更穩(wěn)健和可靠見解的綜合模式。這種方法可以幫助鑒定與特定類型的組織損傷或疾病相關的甲基化變化。通過關注特定的甲基化模式，研究人員可以減少個體變異性的影響，提高甲基化分析的準確性。
外部因素對甲基化模式的影響
由于外部因素對DNA甲基化模式的影響，這種影響可能會干擾組織和器官損傷篩查，診斷和治療的決策。未來的研究可以集中在鑒定和調控可能影響甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和環(huán)境暴露�？梢酝ㄟ^收集有關這些因素的詳細信息的大規(guī)模人群研究以及使用動物模型研究特定暴露對甲基化模式影響的實驗研究來完成。例如，當Kang Li研究HBV與相關慢性肝炎之間的關系以及外周免疫系統(tǒng)的甲基化時，發(fā)現外周免疫系統(tǒng)的甲基化模式受到外部因素的影響。因此，他們將Bonferroni校正應用于代償性肝硬化預測模型構建中的潛在混雜因素，并發(fā)現了真正顯著的相關性。
檢測方法的技術局限性和不一致性
現有的甲基化檢測方法也存在技術缺陷，例如靈敏度和特異性問題。該領域的研究可以集中于開發(fā)更靈敏和更具體的檢測甲基化變化的方法。這可能包括使用納米孔測序和單細胞測序等新技術，以及開發(fā)用于分析甲基化數據的改進生物信息學工具。此外，研究可以集中于鑒定和解決現有甲基化檢測方法的技術局限性。例如，亞硫酸鹽測序是檢測DNA甲基化最常用的方法，由于亞硫酸鹽處理過程中未甲基化C和DNA損傷的不完全轉化，可能會產生偏差和不準確。解決這些問題的新方法，例如使用替代化學處理或改進的酶轉化方法，可以提高甲基化檢測的準確性和可靠性。此外，研究可以調查技術因素對甲基化分析的影響，例如DNA質量和數量，測序深度和文庫制備方法。鑒定和減輕這些因素可以幫助減少變異并提高甲基化研究的可重復性。
結論與展望
甲基化檢測方法在各種情況下表現出檢測器官和組織損傷方面的巨大潛力。這些檢測有望檢測早期損傷、監(jiān)測組織和器官損傷的進展，評估治療效果和預測移植結果。然而，仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，包括甲基化模式的變異性，可能影響甲基化模式的外部因素以及檢測方法的技術局限性。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但人們對這一領域產生了濃厚的興趣，正在進行的研究繼續(xù)確定有前途的標記物，并開發(fā)有效的診斷和監(jiān)測工具。隨著技術的不斷進步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的檢測有可能通過分析血液或其他體液來顯著改善臨床環(huán)境中器官和組織損傷的診斷和管理，這將顯著改善患者獲得診斷測試和監(jiān)測。使用基于DNA甲基化的檢測來預測對不同治療的反應，可以為器官和組織損傷提供個性化醫(yī)療方法。研究表觀遺傳變化（包括DNA甲基化）在器官和組織損傷的發(fā)展和進展中的作用，也將為疾病機制和潛在的新治療靶點提供見解。
參考文獻：Zhang L, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detection of tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168. pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID: 37858233.
Introduction
檢測器官和組織損傷對于及時診斷和有效治療各種疾病和病癥至關重要。早期發(fā)現組織損傷可以及時干預，防止進一步的損傷并可能改善預后。監(jiān)測疾病進展也可以幫助告知治療決策，并根據需要進行調整。此外，評估治療效果可以幫助確定干預措施是否有效，并為繼續(xù)或修改治療計劃的決定提供信息。最后，在移植醫(yī)學中，檢測組織損傷對于評估移植器官的生存能力和確保受體成功結果至關重要。在此前研究中，組織切片的組織病理學檢查通常被認為是檢測組織和器官損傷的“金標準”。然而，這種方法是高度侵入性的，不適用于組織和器官損傷的早期篩查。
CpG位點是DNA上的特定區(qū)域，以C（胞嘧啶）和鳥嘌呤核苷酸命名，通過磷酸二酯鍵連接。這些位點廣泛分布于整個人類基因組中，對基因表達和基因組穩(wěn)定性至關重要。在許多研究中，CpG位點甲基化狀態(tài)與人類疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。DNA甲基化也因組織損傷而變化�；诩谆臋z測為檢測器官和組織損傷提供了一種有前途的方法�；贒NA甲基化模式的表觀遺傳分析包括DNA甲基化模式的研究，以檢測可能反映組織損傷或疾病相關變化的跡象。這些測試方法具有高度的特異性和靈敏度，可應用于各種樣本類型，包括血液、尿液和組織活檢，促進非侵入性數據收集，并大大推進組織損傷的早期診斷。基于甲基化的檢測方法正在研究一系列應用，從早期發(fā)現和監(jiān)測疾病進展到評估治療效果和評估移植器官活力。
液體活檢，特別是血漿中循環(huán)cfDNA甲基化分析，可能成為組織損傷檢測中一種有前途的非侵入性診斷方法。血液或體液樣本的收集是一種非侵入性程序，不需要組織切除或組織活檢，從而避免了傳統(tǒng)組織檢查的痛苦和風險。大多數cfDNA片段的范圍為80-200 bp，長度對應于核小體大小160-180 bp。起源組織解卷積是cfDNA甲基化分析中的關鍵技術，使研究人員能夠根據DNA甲基化模式確定cfDNA來源。該技術基于一個核心概念：不同的組織和器官在其DNA甲基化譜中具有獨特的表觀遺傳特征。因此，當這些組織或器官受損時，例如由于癌癥、創(chuàng)傷或其他導致細胞死亡的疾病，它們會將cfDNA釋放到血液中（圖1A）。研究人員可以分析這些cfDNA樣本中的DNA甲基化模式，并嘗試將其與已知組織特異性DNA甲基化模式的參考數據庫進行比較。通過這種比較，他們可以解卷積或確定給定cfDNA樣品來源組織或器官。這項技術的優(yōu)點是能夠以非侵入性方式檢測和監(jiān)測組織特異性損傷，而不需要傳統(tǒng)的組織活檢。
圖1：cfDNA的來源。
- cfDNA向體液中的釋放來源于組織和器官，包括血液、腦脊液和尿液等。
- 受損的組織和器官將甲基化模式改變的cfDNA釋放到血液中，可以檢測到
如圖1B所示，組織和器官損傷后cfDNA形式的表觀遺傳標記物釋放到血流中，使cfDNA成為評估組織和器官損傷的有價值的生物標志物。此外，cfDNA的表觀遺傳狀態(tài)，包括DNA高甲基化和低甲基化模式，可以提供對組織和器官損傷程度的見解�？傮w而言，cfDNA的DNA甲基化狀態(tài)可用作組織和器官損傷的生物標志物。本文將研究cfDNA甲基化涉及的潛在機制，用于檢測器官和組織損傷的cfDNA甲基化模式的當前研究現狀，以及這些檢測在臨床實踐中的潛在應用。
表觀遺傳學和DNA甲基化
即使DNA序列保持不變，真核基因表達也通過多種機制受復雜調控，這種現象被稱為表觀遺傳學。表觀遺傳調控涉及多種機制，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA等。其中DNA甲基化研究非常廣泛。
在真核生物中，DNA甲基化涉及在DNA甲基轉移酶的催化下，在DNA中C的第5個碳上添加一個甲基，產生了5-mC（5-甲基胞嘧啶），主要位于CpG位點。人類基因組中約有2.8M的CpG位點，但其分布并不均勻。CpG序列平均僅發(fā)生約1%，CGI（CpG島）是密集的區(qū)域，其頻率是平均頻率的五倍以上，通常定義為超過200個堿基對長的基因組區(qū)域，GC含量超過50%，CpG比率超過60%。超過60%的基因，包括具有組織特異性表達模式的基因，在其啟動子區(qū)域和第一外顯子中具有CpG島。
在正常組織基因組中，約70%的CpG位點被甲基化，而大多數CpG島未甲基化。一些CGI基因被甲基化，如非活性X染色體上的基因和印跡基因。甲基化在各種生物過程中起著至關重要的作用，包括細胞生長、分化、X染色體失活、基因組印跡、基因沉默、防御外源基因以及多細胞生物中的異生素代謝。
表觀遺傳機制的研究在科學研究和醫(yī)學中具有巨大意義，增強了對基因調控、疾病發(fā)生和遺傳以及創(chuàng)新療法發(fā)展的理解。
DNA甲基化在器官和組織損傷中的變化機制
DNA甲基轉移酶（DNMTs）是一類在細胞中起關鍵作用的酶，可以調控DNA甲基化。DNMT主要負責向DNA中的胞嘧啶殘基添加甲基，形成5-甲基胞嘧啶，從而實現DNA甲基化。DNMT能夠與DNA結合并識別靶DNA序列，通常是CpG。一旦DNMT與靶DNA序列結合，它們就會將甲基從SAM供體轉移到DNA中的胞嘧啶堿基。該過程涉及形成共價鍵，將甲基添加到胞嘧啶堿基的第五個碳原子上，產生5-mC。DNMT1（DNA甲基轉移酶-1）作為維持DNMT，主要任務是在DNA復制和細胞分裂過程中維持DNA甲基化穩(wěn)定性。DNMT1可以識別新合成的未甲基化DNA鏈，并在DNA復制過程中添加甲基，以確保每一代細胞中DNA甲基化模式的正確遺傳。
DNMT3A和DNMT3B是de novo的DNMT，負責在細胞分化和發(fā)育過程中引入新的DNA甲基化。這些酶可以將甲基引入特定基因或基因組區(qū)域，從而調控基因表達并影響細胞功能。
DNA去甲基化：除DNMT外，DNA去甲基化酶（如TET（10-11易位））也是DNA甲基化動態(tài)平衡的關鍵組成部分。TET酶可以從DNA中去除甲基，將5-mC轉化為5hmC（5-羥甲基胞嘧啶），并參與DNA去甲基化過程。AID（activation-induced cytidine deaminase，活化誘導的胞嘧啶脫氨酶）和AB（Apobec）是脫氨酶，通常與DNA堿基脫氨和脫氧核糖修飾有關，而不是直接參與DNA甲基化或去甲基化反應。它們在改變DNA堿基方面起作用，例如將胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而不涉及DNA甲基的添加或去除。TDG（胸腺嘧啶DNA糖基化酶）和SMUG1（單鏈選擇性單功能尿嘧啶DNA糖基化酶1）是與DNA修復相關的兩種酶，在維持DNA堿基的完整性和糾正DNA堿基錯誤方面起著至關重要的作用。這些酶向DNA分子引入脫氨或脫氧核糖基化等變化，影響DNA甲基化狀態(tài)。組織和器官損傷可以通過各種機制調控DNMT和DNA去甲基化酶，從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應激和DNA損傷修復機制。這些機制可以相互作用，引起DNA甲基化模式的復雜變化，并導致?lián)p傷和疾病的持續(xù)（圖2）。
圖2：器官和組織損傷中的DNA甲基化和去甲基化機制。組織和器官損傷可以通過各種機制調控DNMT和DNA去甲基化酶（如TET和TDG），從而影響DNA甲基化狀態(tài)，包括炎癥、氧化應激和DNA損傷修復機制
炎癥
在組織和器官損傷后，身體啟動炎癥反應以清除受損的細胞和組織，促進修復和再生。然而，這種炎癥反應也可能導致DNA甲基化變化，因為炎癥反應可以產生活性氧（ROS），亞硝酸鹽和其他可能直接或間接影響DNA甲基化的有害物質。炎癥還可以激活免疫細胞，導致細胞因子和其他信號分子的分泌，從而改變DNA甲基化模式。例如，IL-6（細胞因子白細胞介素-6）和STAT3（信號轉導和轉錄激活因子3）已被證明可增加DNMT活性，從而導致某些基因的DNA甲基化增加。過量的IL-15（細胞因子白細胞介素-15）在動物模型中誘導DNMT3b（DNA甲基轉移酶-3b）上調和整體DNA高甲基化。
氧化應激
由于受損細胞釋放的自由基、過氧化物和其他氧化劑，組織和器官損傷可能會增加細胞氧化應激，可能會破壞DNA并改變調控DNA甲基化的酶活性。例如，氧化應激可導致DNMT氧化，導致活性改變和DNA甲基化模式改變。在最近對Graves病患者外周血單核細胞的研究中，發(fā)現活性氧增加導致DNMT1表達增加，反過來又與促進Graves病自身免疫的免疫調控基因異常甲基化模式有關。類似地，在多柔比星誘導的心臟毒性的研究中，多柔比星誘導心臟細胞損傷和氧化應激，其產生自由基和一氧化氮以響應應激。氧化應激增加并下調DNMT1酶活性，導致DNA甲基化的線粒體功能障礙。氧化應激還可以改變從DNA中去除甲基的酶（如TET酶）活性，從而導致DNA甲基化模式變化。在多囊卵巢綜合征疾病研究中構建的細胞損傷模型中，發(fā)現細胞損傷降低了TET水平并導致細胞甲基化水平升高。
DNA損傷修復
DNA損傷是組織和器官損傷的常見后果，DNA修復機制被激活以修復損傷。DNA修復過程可以影響DNA甲基化模式，因為一些DNA修復酶可以改變DNA甲基化水平。例如，PARP1酶（聚（ADP-核糖）聚合酶-1）是一種參與DNA修復、染色質重塑和基因表達的核酶（nuclear enzyme），可以催化甲基全基因組染色質去除。PARP1與染色質全基因組的結合與DNA甲基化模式互斥，表明PARP1與DNA甲基化之間存在功能互作。事實上，抑制PARylation會導致DNA甲基化模式的全基因組變化。DNA雙加氧酶AlkB也可以調控DNA甲基化水平，AlkB可以通過在Fe（II）離子，α-KG和氧氣存在下的氧化去甲基化機制將m3C和m1A直接轉化為未甲基化堿基。在一項血液疾病研究中，生發(fā)中心的B細胞在DNMT1幫助下分化，改變其DNA模式以正確分化。DNMT1在DNA甲基化和雙鏈斷裂修復中發(fā)揮雙重作用。
總之，組織和器官損傷可以通過多種機制引起DNA甲基化模式變化，這些機制可以互作以產生DNA甲基化模式的復雜變化。
5-mC甲基化檢測技術
研究人員利用各種DNA甲基化檢測方法研究cfDNA中的甲基化，從而了解健康和疾病狀態(tài)下的甲基化變化。這些方法主要包括一系列5-mC甲基化檢測，可分為以下幾類：
非測序的甲基化檢測方法
非測序甲基化檢測方法通常不涉及DNA測序，而是依賴各種化學或生物技術來分析DNA甲基化狀態(tài)。這些方法包括限制性酶消化，包括使用甲基化敏感酶在特定核苷酸序列切割DNA，從而可以研究DNA甲基化。例如，von Kanel等人結合限制性內切酶消化和實時PCR或Xianfeng Wang等人基于CRISPR/Cas13a的策略等方法能夠精確評估單個位點的甲基化狀態(tài)和拷貝數變化。此外，MSP（甲基化特異性PCR）和其他使用亞硫酸鹽處理的DNA模板的基于PCR的方法是分析特定位點DNA甲基化的靈敏和特異性技術，MSP使用甲基化特異性引物選擇性擴增甲基化或未甲基化的DNA序列。這些方法，包括TaqMan實時FQ-MSP（TaqMan實時甲基化特異性PCR）和ddPCR（數字液滴PCR），提供了高精度和靈敏度，使其成為研究DNA甲基化的有價值的工具。例如，MSP聯(lián)合ddPCR已被用于檢測原發(fā)性硬化性膽管炎患者的膽管癌標志物。此外，HRM（高分辨率熔解）是一種基于甲基化和非甲基化DNA片段的不同熔解行為檢測DNA甲基化的方法。HRM允許對DNA甲基化進行定性和定量分析，而不需要昂貴的測序技術，從而提供了一種廣泛用于DNA甲基化研究的快速，高通量和經濟高效的方法。Wojdacz和Dobrovic的MS-HRM（甲基化靈敏的高分辨率熔解）方案可以檢測未甲基化中的甲基化panel，其靈敏度與MSP相當。Lasse Kristensen等人還開發(fā)了一種無探針定量MSP分析方法，使用HRM分析進行可靠檢測，即使在0.1%甲基化標準下也是如此。此外，甲基化芯片如Illumina的HM450K（Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip）和850K（Illumina Infinium methylation EPIC Bead Chip）為全面的甲基化分析提供了具有成本效益和高通量的平臺，HM450K靶向人類基因組中超過485000個胞嘧啶位點，并被廣泛用于癌癥研究。較新的850K芯片擴展了覆蓋范圍，包括針對調控區(qū)的其他探針，但這些陣列的全基因組覆蓋范圍有限，可能無法捕獲所有甲基化信息�，F已更新至935k芯片。
測序的甲基化檢測方法
基于測序的DNA甲基化檢測方法包括一系列用于研究DNA甲基化模式的技術。一種廣泛使用的方法是BSP（亞硫酸鹽測序PCR），它將PCR擴增與Sanger測序相結合，以鑒定單個CpG位點的甲基化位點。BSP有兩種形式：直接BSP，它直接對PCR產物進行測序，克隆BSP，它涉及將PCR產物克隆到載體中進行測序。然而BSP具有局限性，例如對低水平鑲嵌的靈敏度和潛在的PCR誘導的偏倚。
焦磷酸測序通過定量檢測核苷酸的摻入來實時高分辨率和靈敏地監(jiān)測DNA甲基化，這對于各種研究和臨床應用都很有價值，包括癌癥預測和重復元素研究。
WGBS（全基因組重亞硫酸鹽測序）提供了全面和高分辨率的全基因組甲基化信息，是甲基化檢測的“金標準”，但它面臨著復雜的數據處理和高測序要求等挑戰(zhàn)。另一方面，MCTA-seq（甲基化CpG串聯(lián)擴增和測序）是一種靈敏的方法，能夠分析微小的基因組DNA量（低至7.5 pg），有望用于非侵襲性癌癥篩查。然而，與全基因組方法相比，它可能需要專門的設備，且覆蓋范圍有限。
靶向亞硫酸鹽測序（Target-seq）選擇性地擴增特定的基因組區(qū)域，將甲基化陣列的成本效益與亞硫酸鹽測序的數字信號相結合。可以針對特定的基因或區(qū)域進行定制，但可能需要額外的時間和資源來進行探針設計和合成。
RRBS（減少代表性亞硫酸鹽測序）是一種經濟有效的方法，專注于CpG富集區(qū)域，并實現了scRRBS（單細胞RRBS）等進步，為腫瘤負荷估計和疾病生物標志物發(fā)現提供了見識。
MeDIP-Seq（甲基化DNA免疫沉淀測序）減少了甲基化測序所需的DNA input，使其適用于cfDNA甲基化檢測。該方法的擴展cfMeDIP-seq（cfDNA甲基化DNA免疫沉淀和高通量測序）可應用于DNA可用性有限的各種樣品類型，可能將其應用擴展到癌癥檢測之外。
MBD-Seq（CpG甲基化結合結構域富集測序）使用MBD（甲基CpG結合結構域）蛋白選擇性捕獲甲基化DNA片段，有效鑒定和定量甲基化區(qū)域，特別是CpG和CGI富集區(qū)域。超低 input cfDNA甲基化分析方法cfMBD-seq（cfDNA-MBD-seq）優(yōu)化了用于各種樣品類型的MBD捕獲條件。
納米孔測序是一種革命性的技術，可直接檢測DNA分子通過納米孔時的電流變化，從而實現直接甲基化檢測，而無需化學修飾。例如ONT（牛津納米孔技術）具有高通量、高分辨率和單分子測序等優(yōu)點，在包括癌癥檢測在內的各種研究和臨床應用中具有重要價值。然而它有局限性，包括單核苷酸變異和插入/缺失的每堿基成本和錯誤率較高。
基于SMRT（單分子實時）技術的PacBio測序產生異常長的DNA讀長，使其適用于研究復雜的基因組，結構變異，重復序列和重復元件的表觀遺傳變化。可以在沒有GC或AT含量偏好的情況下分析不同的基因組和DNA樣品。
cfDNA甲基化檢測特異性組織及器官損傷的研究現狀
基于cfDNA甲基化的檢測在檢測組織和器官損傷方面具有巨大潛力，該領域的進一步研究可以為各種組織和器官疾病提供新的診斷和預后工具。以下描述了cfDNA甲基化在檢測特定器官組織和器官損傷中的研究現狀（表1）。
表1：特定組織和器官損傷的cfDNA甲基化標記
肝臟
基于肝源性cfDNA甲基化檢測方法已被用于檢測各種情況下的肝損傷，包括乙型肝炎和丙型肝炎感染、非酒精性脂肪肝、肝細胞癌和肝移植。Miguel Waterhouse等人使用數字液滴PCR檢測cfDNA中PTK28基因特異性甲基化標記，以檢測急性移植物抗宿主病患者的肝組織損傷。區(qū)分肝臟中aGvHD（急性移植物抗宿主�。┖头莂GvHD（非急性移植物抗宿主病）的閾值為1.5（靈敏度=0.928；特異性=0.910），肝損傷aGvHD的臨床改善導致甲基化PTK2B濃度降低。在另一項關于癌癥對宿主組織損害的研究中，發(fā)現受癌癥影響的器官中細胞死亡可以通過cfDNA組織特異性甲基化模式來檢測。在肝細胞癌研究中，通過Illumina Infinium 450k芯片鑒定了三種肝組織甲基化特異性標志物（cg02396797/ cg030646442/cg21178851）。與健康供體、局部癌癥患者或非肝轉移性疾病患者相比，肝轉移患者表現出更高水平的肝細胞來源cfDNA，無論是通過肝細胞來源cfDNA比例或每毫升肝細胞基因組當量來檢測。使用561（基因組當量/mL）的肝源性特異性cfDNA標記物，檢測肝轉移和肝損傷的特異性和靈敏度分別為95%和35%。此外，肝細胞cfDNA水平能夠區(qū)分有無肝轉移的4期癌癥患者（AUC=0.81，95%置信區(qū)間0.73-0.89，P<0.0001）。另一項研究描述了一種通過基于攜帶肝細胞特異性甲基化模式的cfDNA片段的定量鑒定肝細胞中特異性非甲基化的三個基因組位點（ITIH4，IGF2R和VTN）來檢測急性肝細胞死亡的方法。通過ddPCR分析了來自健康個體、肝移植患者、肝臟供體、敗血癥患者和杜興氏肌營養(yǎng)不良癥的血液樣本，結果表明，這三種肝細胞來源的cfDNA分析可以提供有關肝細胞死亡的特定和敏感信息。它提供了肝損傷的近實時指示，并可以動態(tài)監(jiān)測肝損傷。
腎臟
基于甲基化的檢測方法已越來越多地用于檢測腎臟損傷并了解與腎臟疾病相關的潛在分子機制。在腎臟患者中觀察到特定基因啟動子區(qū)域的高甲基化。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了健康對照組和急性腎損傷患者尿液和全血中cfDNA的KLK1基因啟動子區(qū)四個位點的甲基化狀態(tài)。結果表明，AKI患者血液和尿液中甲基化的KLK1基因啟動子在全基因組模式中高于健康對照組（P<0.0001），表明KLK1基因甲基化有可能成為監(jiān)測腎損傷的標志物。在另一項研究中，手術后第二天，通過定量甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測到13名死者和10名活體腎移植受者以及65名健康對照者尿液DNA中兩個基因啟動子（DAPK和CALCA）的異常甲基化，移植受者尿液中發(fā)現CALCA基因啟動子異常甲基化的可能性明顯高于健康對照組（100%比31%；P<0.0001）。與活體供體移植相比，死亡患者尿液中鈣質高甲基化增加（21.60） ± 12.5比12.19 ± 4.7條；P = 0.04）。此外，與急性排斥反應和緩慢或快速移植功能相比，活檢證實的急性腎小管壞死患者的尿鈣異常高甲基化增加（平均值：20.40±6.9、13.87±6.49、17.17±13.4；P=0.67）（16.9±6.2和18.5±13.7；P=0.5）。這些結果表明，尿DAPK和CALCA基因表觀遺傳學是一種有前途的急性缺血性損傷生物標志物腎移植方法。在一項針對腎移植患者的研究中，分析了尿液cfDNA，以了解感染與腎組織損傷之間的關系。結果顯示，移植后組織特異性cfDNA尿液絕對濃度由于應激損傷而增加，但在沒有感染的10天后恢復到基線。腎病合并BK病毒感染患者的腎源性cfDNA水平顯著高于正常人和單純BK病毒感染患者（P=4×10-4，P=7.9×10-3）。此外，細菌感染患者的膀胱和白細胞cfDNA水平升高（AUC=0.91），表明感染與組織損傷之間可能存在相關性。cfDNA片段大小譜可以提供一個指標，通過該指標可以對具有不同感染癥狀的患者進行分層。這些發(fā)現表明，分析cfDNA水平可以提高我們對感染相關腎損傷的理解，并可能導致更好的診斷工具和治療方法。
心臟
基于cfDNA甲基化的檢測已被用于檢測各種情況下的心臟損傷，包括心臟直視手術和MI（心肌梗塞）。一項新的研究評估了cfDNA分子的六個非甲基化位點作為心臟直視手術后心臟損傷的標志物。使用六種心肌細胞特異性DNA非甲基化標記物檢測42名接受心臟直視手術的嬰兒血漿中的心臟cfDNA。手術后心臟cfDNA升高，反映了與手術直接相關的組織損傷，大多數患者術后cfDNA降低。本研究還使用心臟cfDNA水平來預測手術結果，選擇機械通氣持續(xù)時間（大于或小于24小時）和最大VIS（大于或小于20小時），并使用ROC（接受者操作特征）曲線作為臨床結果。作為機械通氣持續(xù)時間或最大VIS的預測指標，術后6小時心臟cfDNA的AUC分別為0.7475和0.7555。類似地，在另一項研究中鑒定出心肌細胞甲基化標記物（FAM101A）。ddPCR用于檢測完全未甲基化的FAM101A的血漿cfDNA濃度，其可以靈敏且特異性地檢測心肌細胞損傷。膿毒癥患者的臨床觀察表明，心臟cfDNA水平不受腎臟或肝臟損傷的顯著影響。Jie Ren等人發(fā)現，當心肌損傷發(fā)生時，cfDNA被釋放并鑒定出位于CORO6、CACNA1C（兩個位點）、OBSCN、CRIP1和ZNF503-AS2的CGI中的六個CGCGCGG位點，顯示出心臟特異性高甲基化模式。在這些標記物中，CORO6在心臟中顯示出最特異性甲基化模式。繼續(xù)研究針對該特定位點的ddPCR測定法的開發(fā)，該測定法有效地檢測了MI患者入院時cfDNA中心臟損傷的信號。
肺
基于肺器官特異性cfDNA甲基化檢測已被用于檢測各種情況下的肺損傷，包括慢性阻塞性肺病、肺癌、肺結節(jié)和支氣管檢查后。在2022年的研究中鑒定了17個具有肺特異性甲基化模式位點的甲基化狀態(tài)，并將其用于評估健康志愿者和肺部疾病患者血漿中肺源性cfDNA。結果表明，正常肺上皮的cfDNA甲基化標記允許對肺源性cfDNA進行突變獨立、靈敏和特異性檢測，從而報告正在進行的肺損傷。Wenhua Liang等人開發(fā)了一種新的非侵入性診斷方法，該方法基于肺損傷釋放的cfDNA甲基化分析中的9種標志物來檢測早期肺癌并將肺癌與良性肺結節(jié)區(qū)分開，該模型特異性達到93.2%。這九個標記是cg19864007\U cg22636429\U cg15542994、cg26970841\U cg03978375\U CG2482667、cg04175417、cg21962423、cg23156742、cg06287318、cg21963643、cg07568344和cg12545252。
腦
在2022年探索側支組織損傷的液體活檢研究中，還鑒定了10個基因組位點，這些位點在神經元（cg13131859/cg10030512/cg12560421/cg18519737）、少突膠質細胞（cg26765599/cg20637405/cg25396488）或星形膠質細胞（cg22031783/cg01623475/cg01623475）中未甲基化。來自每種腦細胞類型的信號產生ROC曲線，每種腦細胞類型的標志物都能夠識別腦轉移患者的血漿，AUC為0.72-0.81，神經元標志物的95%特異性、靈敏度為17.2%，星形膠質細胞標志物的95%特異性、靈敏度為13.8%。
胰腺
甲基化組織研究已經能夠在器官中定位特定細胞類型，并且可以通過cfDNA甲基化分析檢測細胞損傷。例如，在血漿胰腺β細胞特異性cfDNA的研究中，發(fā)現70%的β細胞中有六種特異性生物標志物（Fbxl19、Mtg1、Leng8、Zc3h3、INS、INS反義）完全未甲基化，其余30%表現出一個或兩個CpG位點甲基化。該研究發(fā)現胰島移植后胰島β細胞中cfDNA甲基化標志物顯著升高，反映了β細胞的損傷和死亡。此外，鑒于β細胞中未甲基化INS-CpG位點頻率增加，細胞死亡后釋放到循環(huán)中的未甲基化與甲基化INS-DNA比例反映了β細胞死亡。一項研究在編碼PRMT1染色質靶標（CHTOP）的基因內鑒定了一個基因內CpG位點，該位點對INS具有互補的組織特異性，可用于增加糖尿病前期和糖尿病青年檢測胰島損傷的信心。兩種未甲基化生物標志物組合的特異性高達100%。
肌肉
肌萎縮側索硬化癥（ALS）是一種進行性神經退行性疾病，可導致上運動神經元和下運動神經元死亡。目前，尚無確定的ALS循環(huán)生物標志物。因此，很難監(jiān)測疾病進展并有效評估治療反應。cfDNA提供了一個檢測ALS細胞死亡的機會，填補這些空白。在一項研究中，從20名ALS患者和20名對照中分離出血漿cfDNA，與對照組相比，cfDNA用于鑒定ALS患者RHBDF2基因中的新型差異甲基化標記。該研究進行了ROC分析，以確定RHBDF2基因ALS的診斷效果。其中，RHBDF2基因具有兩個增強子區(qū)域，即CpG1和CpG2。CpG1的AUC為0.724（CI 0.559-0.888；P=0.017），CpG2的AUC為0.695（CI 0.527-0.863；P=0.038）。區(qū)分ALS患者和對照組的最佳閾值為CpG1的65.97%（靈敏度=0.850，特異性=0.526）和CpG2的83.26%（靈敏度=0.800，特異性=0.474）。在現有研究中，針對甲基化cfDNA開發(fā)了一種高校的EM（期望最大化）算法CelFiE（通過期望最大化進行cfDNA分析），其中CelFiE的input是WGBS參考數據，允許低覆蓋率和噪聲數據。在該研究中，使用CelFiE從ALS患者和年齡匹配的對照中檢測到cfDNA。ALS和對照中cfDNA的總體豐度顯示出顯著差異。ALS組（n=28，平均值=297.2±110.57 pg/ul）和對照組（n=25，平均值=218.78±139.17 pg/ul）。肌萎縮側索硬化組（ALS組）骨骼肌比例估計值與對照組相比有顯著性差異（P=5.02×10-2）�？傊�，這些結果表明cfDNA是鑒定肌肉萎縮和死亡的第一個定量生物標志物的有希望的方向，這是ALS的標志。
總的來說，人們對使用基于甲基化檢測方法來檢測器官和組織損傷的跡象越來越感興趣，并且在各種情況下發(fā)現了許多有希望的標記物（圖3）。然而，需要進一步的研究來驗證這些組織特異性甲基化標記，并開發(fā)有效的臨床診斷和預后工具。
從組織器官損傷特異性cfDNA甲基化標志物鑒定到臨床檢測路徑
基于甲基化的損傷檢測依賴于組織和器官損傷后DNA甲基化模式變化。甲基化模式對于每種細胞類型都是特異性的，在同一個體內部和同一細胞類型中保守，并且在生理或病理條件下高度穩(wěn)定。因此有可能利用與組織和器官損傷相關的特定cfDNA甲基化模式來鑒定起源組織并推斷組織和器官損傷的程度。鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標記及其在臨床檢測中的應用需要多步驟方法。然而，鑒于新生物標志物的不斷發(fā)現和提出，建立一個強大的生物標志物驗證和認證系統(tǒng)以確保廣泛接受和正確使用成為當務之急。遵循生物標志物認證的各種原則，推斷鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標志物并將其應用于臨床檢測過程可能需要幾個不同的階段，如圖4所示。值得注意的是，利用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于早期研究階段。到目前為止，還沒有進行臨床研究，也沒有將商業(yè)產品引入臨床環(huán)境。
圖4：cfDNA甲基化檢測組織器官損傷的發(fā)展路徑。該路徑概述了將潛在標志物轉化為診斷和監(jiān)測組織和器官損傷的臨床有用工具所必需的研究和開發(fā)進展
鑒定和驗證潛在的甲基化標記
美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）對生物標志物的使用設定了四個類別：預后性、預測性、反應指示性和療效反應性（表2）。首先，通過進行文獻綜述，并確定與組織和器官損傷相關的潛在甲基化標志物。這可以通過響應損傷的甲基化變化的研究或者已經鑒定與健康組織相比患病組織中的DMR（差異甲基化區(qū)域）的研究來完成。例如在肝損傷生物標志物的研究中，通過檢查WGBS數據并鑒定差異甲基化或差異非甲基化區(qū)域來選擇肝細胞特異性CpG位點。為了選擇高甲基化標記，確定了肝細胞樣品的75th百分位數和所有非肝細胞樣本的5th百分位數之間差異超過0.5的區(qū)域。對于低甲基化標記物，需要在95th和20th百分位數之間有0.5的差異。通過這種方式，總共篩選出三種肝細胞標志物（cg02396797、cg030646442、cg21178851）。甲基化DNA數據庫是研究與組織損傷相關的DNA甲基化模式的寶貴資源。這些數據庫可用于鑒定生物標志物、理解分子機制、評估嚴重程度、監(jiān)測治療反應以及研究環(huán)境和生活方式因素。數據庫包括參考序列數據庫、癌癥相關數據庫和疾病相關數據庫（表3）。這些數據庫為有興趣鑒定與組織和器官損傷相關的甲基化標記的研究人員提供了寶貴的資源。
表2：FDA生物標志物分類表3：常見DNA甲基化數據庫的內容和網站建立檢測分析
一旦確定了潛在的甲基化標記，就需要開發(fā)一種甲基化檢測方法，可以準確檢測這些標記中的甲基化變化。根據所分析的特定標記，檢測方法可以基于不同的技術，例如MSP（甲基化特異性PCR）、焦磷酸測序（pyrosequencing）、WGBS（全基因組甲基化測序）或DNA甲基化芯片。設計分析方法后，需要優(yōu)化檢測參數，包括優(yōu)化引物設計、退火溫度（annealing temperature）、循環(huán)條件和檢測方法等檢測參數，以確保準確可靠地檢測已鑒定標記中的甲基化變化。
例如Miguel Waterhouse開發(fā)了基于PTK1B和SESN3基因甲基化的ddPCR甲基化測定法，以分析急性移植物抗宿主病患者的組織損傷。同樣Tulsi K.Mehta等人設計了特異性擴增CALCA基因的引物和探針，以開發(fā)一種qPCR（定量PCR）檢測方法，該方法有望用于評估移植環(huán)境中的急性腎損傷。在人類急性腎損傷的研究中，通過焦磷酸測序評估了KLK1基因的四個連續(xù)CpG甲基化，位于轉錄起始位點上游-203bp至-135bp之間。在cfDNA甲基化研究中，Roni-Lehmann-Werman等人建立了ddPCR程序來檢測cfDNA中ITIH4、IGF2R和VTN的甲基化狀態(tài)，其中甲基化敏感的TaqMan探針用于分析亞硫酸氫鹽處理的cfDNA。探針的有限長度（最多30 bp）決定了它們只能覆蓋2-4個提供信息的CpG位點。IGF2R位點覆蓋了四個CpG。VTN位點的探針中只覆蓋兩個CpGs ，預測非肝組織DNA中相對較高的噪聲頻率（陽性液滴）。設計了兩個TaqMan探針以提高特異性，每個探針都從VTN位點相同擴增的100 bp片段中鑒定出不同嘧啶簇（每個簇包含兩個CpG位點）中的甲基化缺失，并且每個探針都用不同的熒光團標記。
分析有效性
分析有效性是驗證檢測方法的一個重要方面，該檢測方法評估所開發(fā)測定的準確性和可靠性，包括精確度、靈敏度和特異性。為了確保所開發(fā)的甲基化檢測方法的分析有效性，應采取以下步驟：
精確度評估：使用已知甲基化狀態(tài)的對照樣品，評估檢測方法的精確度。通過分析重復樣品來計算內部精確度和外部精確度，以確定方法的精確度。
靈敏度評估：使用已知甲基化水平較低或甲基化變化較小的樣品，評估檢測方法的靈敏度。評估該方法準確檢測微小甲基化變化的能力。
特異性評估：使用具有不同甲基化模式或來自不同來源的樣品，評估檢測方法的特異性。確定該方法準確檢測甲基化變化而無假陽性的能力。
使用具有已知甲基化狀態(tài)的對照樣品驗證開發(fā)的測定法有助于建立檢測方法的準確性和靈敏度。這有助于評估該方法在甲基化檢測中的性能，并為其臨床應用提供可靠的基礎。
臨床有效性
在建立分析有效性后，會啟動臨床研究以建立臨床有效性：證明生物標志物和檢測方法適合特定使用背景的目的，即分析結果將為醫(yī)療決策提供信息。應使用臨床樣品評估所開發(fā)檢測方法的臨床有效性，例如從具有特定組織或器官損傷的患者獲得的血液或組織樣品。該驗證過程旨在確定該測定是否可以有效區(qū)分有損傷和無損傷患者，并評估損傷個體的臨床靈敏度、臨床特異性和檢出率。臨床靈敏度是指測定正確鑒定具有特定組織或器官損傷的個體的能力，而臨床特異性是指測定正確識別沒有損傷的個體的能力。應評估該測定的靈敏度和特異性，以確定其在臨床環(huán)境中的準確性。此外，應評估受傷個體的檢出率，這反映了臨床診斷為受傷的患者中陽性結果的比例。這些信息可以幫助評估檢測方法在檢測預期患者群體中特定組織或器官損傷方面的性能。
例如，基于PTK1B基因的ddPCR甲基化檢測方法在28名急性移植物抗宿主�。╝GvHD）患者和11名無相關癥狀的患者中進行了臨床驗證，區(qū)分肝臟aGvHD與非aGvHD的最佳閾值為1.5（logPTK2拷貝/mL血漿；靈敏度：0.928；特異性：0.910）。同樣，Asel Lubotzky等人招募了65名健康供體、85名局部癌癥（非肝臟）患者、55名非肝臟轉移性癌癥患者和63名有肝臟轉移的癌癥患者，以驗證基于cfDNA PCR測序分析的檢測方法在區(qū)分肝臟轉移方面的表現。結果表明，通過這種方法檢測到的肝細胞的AUC濃度為0.81（95%置信區(qū)間=0.74–0.87，P= 0.0001）。肝臟轉移檢測的特異性和靈敏度分別為95%和35%。
臨床效用
臨床效用是指在考慮PPV（陽性預測值）、NVP（陰性預測值）和成本等因素下，評估患者檢測中開發(fā)的檢測方法的成本效益。臨床效用的評估可以考慮多種因素，包括但不限于以下因素。
診斷準確性：評估甲基化檢測方法在正確鑒定患者組織或器官損傷方面的靈敏度、特異性、PPV和NPV。臨床影響：評估甲基化檢測方法對治療決策和患者管理的影響，例如它是否有助于選擇適當的治療選項、監(jiān)測治療反應或預測疾病復發(fā)。
成本效益：考慮與甲基化檢測過程相關的成本，包括樣本收集、實驗室檢測、數據分析和結果解釋，并將其與潛在的益處進行權衡，如改善患者結果、降低醫(yī)療保健成本和提高患者滿意度。
可行性和可擴展性：評估在臨床環(huán)境中實施甲基化檢測方法的實際可行性，包括樣本收集的便利性、所需的實驗室基礎設施和專業(yè)知識，以及擴展到更大患者人群的可擴展性。
比較效果：在準確性、臨床影響和成本效益方面，將甲基化檢測方法與現有的標準診斷方法或替代方法進行比較。
倫理和法律考慮：在評估臨床效用時，考慮倫理和法律考慮因素，如患者隱私、知情同意和遵守監(jiān)管要求。
總之，鑒定與組織和器官損傷相關的特定甲基化標記物，并將其應用于臨床檢測，需要一種嚴格和系統(tǒng)的方法，涉及多個研究、驗證和檢測階段。然而，值得注意的是，目前使用甲基化分析進行組織損傷檢測仍處于研究的早期階段，迄今為止，尚未進行臨床研究，也未在臨床環(huán)境中實施任何商業(yè)產品。
研究人員、臨床醫(yī)生和行業(yè)伙伴之間的合作對于確保基于甲基化的診斷檢測方法的成功開發(fā)和臨床應用非常必要。
挑戰(zhàn)和未來方向
結合之前的討論，研究甲基化標記物在組織和器官損傷中的應用存在一些挑戰(zhàn)。挑戰(zhàn)和未來的研究方向包括：
個體之間甲基化模式的變異性
根據之前的大量研究，DNA甲基化模式在個體之間差異很大，并且與性別、生活環(huán)境和許多其他因素有關。因此，在臨床上使用DNA甲基化分析來檢測組織損傷仍然存在許多困難。這一挑戰(zhàn)的一個潛在解決方案是使用大規(guī)模研究來確定跨人群一致的甲基化模式，而不是依賴于單個標記。這種方法可以幫助鑒定不同個體之間常見的甲基化模式，并且可以用作鑒定與不同組織或器官相關的甲基化變化的參考。通過鑒定這些常見模式，研究人員可以減少個體變異性的影響，提高甲基化分析的準確性。另一種方法包括利用機器學習算法來辨別特定類型組織損傷所特有的甲基化模式。這種方法不再僅僅依賴于可能受個體變異性影響的個體標記，而是側重于能夠提供更穩(wěn)健和可靠見解的綜合模式。這種方法可以幫助鑒定與特定類型的組織損傷或疾病相關的甲基化變化。通過關注特定的甲基化模式，研究人員可以減少個體變異性的影響，提高甲基化分析的準確性。
外部因素對甲基化模式的影響
由于外部因素對DNA甲基化模式的影響，這種影響可能會干擾組織和器官損傷篩查，診斷和治療的決策。未來的研究可以集中在鑒定和調控可能影響甲基化模式的外部因素，如生活方式因素和環(huán)境暴露�？梢酝ㄟ^收集有關這些因素的詳細信息的大規(guī)模人群研究以及使用動物模型研究特定暴露對甲基化模式影響的實驗研究來完成。例如，當Kang Li研究HBV與相關慢性肝炎之間的關系以及外周免疫系統(tǒng)的甲基化時，發(fā)現外周免疫系統(tǒng)的甲基化模式受到外部因素的影響。因此，他們將Bonferroni校正應用于代償性肝硬化預測模型構建中的潛在混雜因素，并發(fā)現了真正顯著的相關性。
檢測方法的技術局限性和不一致性
現有的甲基化檢測方法也存在技術缺陷，例如靈敏度和特異性問題。該領域的研究可以集中于開發(fā)更靈敏和更具體的檢測甲基化變化的方法。這可能包括使用納米孔測序和單細胞測序等新技術，以及開發(fā)用于分析甲基化數據的改進生物信息學工具。此外，研究可以集中于鑒定和解決現有甲基化檢測方法的技術局限性。例如，亞硫酸鹽測序是檢測DNA甲基化最常用的方法，由于亞硫酸鹽處理過程中未甲基化C和DNA損傷的不完全轉化，可能會產生偏差和不準確。解決這些問題的新方法，例如使用替代化學處理或改進的酶轉化方法，可以提高甲基化檢測的準確性和可靠性。此外，研究可以調查技術因素對甲基化分析的影響，例如DNA質量和數量，測序深度和文庫制備方法。鑒定和減輕這些因素可以幫助減少變異并提高甲基化研究的可重復性。
結論與展望
甲基化檢測方法在各種情況下表現出檢測器官和組織損傷方面的巨大潛力。這些檢測有望檢測早期損傷、監(jiān)測組織和器官損傷的進展，評估治療效果和預測移植結果。然而，仍有一些挑戰(zhàn)需要克服，包括甲基化模式的變異性，可能影響甲基化模式的外部因素以及檢測方法的技術局限性。盡管存在這些挑戰(zhàn)，但人們對這一領域產生了濃厚的興趣，正在進行的研究繼續(xù)確定有前途的標記物，并開發(fā)有效的診斷和監(jiān)測工具。隨著技術的不斷進步和DNA甲基化模式的更好理解，基于甲基化的檢測有可能通過分析血液或其他體液來顯著改善臨床環(huán)境中器官和組織損傷的診斷和管理，這將顯著改善患者獲得診斷測試和監(jiān)測。使用基于DNA甲基化的檢測來預測對不同治療的反應，可以為器官和組織損傷提供個性化醫(yī)療方法。研究表觀遺傳變化（包括DNA甲基化）在器官和組織損傷的發(fā)展和進展中的作用，也將為疾病機制和潛在的新治療靶點提供見解。
參考文獻：Zhang L, Li J. Unlocking the secrets: the power of methylation-based cfDNA detection of tissue damage in organ systems. Clin Epigenetics. 2023 Oct 19;15(1):168. pii: 10.1186/s13148-023-01585-8. doi: 10.1186/s13148-023-01585-8. PubMed PMID: 37858233.
標簽：
DNA甲基化
