液相篩選相關(guān)問題及解答

一．緩沖液的選擇

 

緩沖液的選擇不僅要考慮目標(biāo)物的穩(wěn)定性，還要考慮與微環(huán)境結(jié)合的實(shí)際應(yīng)用情況，盡量減少非特異性結(jié)合。使用無關(guān)蛋白質(zhì)、非離子劑除垢劑和生理鹽濃度有利于降低背景。同時(shí)還有一些其他條件，如有些靶標(biāo)可能需要在緩沖液中添加二價(jià)陽離子或其他輔助因子，蛋白質(zhì)輔助因子可以與靶標(biāo)共同固定，也可以添加到分選緩沖液中，甚至可以作為捕獲靶標(biāo)的一種方法。

 

二．選擇壓的考慮

 

常見的選擇性壓力考慮因素包括：目標(biāo)分子的濃度、結(jié)合時(shí)間和洗滌強(qiáng)度。提高選擇壓力的其他技術(shù)包括使用變性劑（如酸、尿素和胍）、有機(jī)溶劑、提高溫度或增加洗滌緩沖液中競爭配體或目標(biāo)物的濃度。第一輪篩選尤為重要，其目的是從構(gòu)建的文庫中捕獲盡可能多的陽性克隆，同時(shí)去除非特異性克隆，篩選時(shí)應(yīng)使用多孔后涂層靶標(biāo)或大量可溶性靶標(biāo)，以確保捕獲大量結(jié)合噬菌體，從而保持文庫的多樣性。

 

三．如何減少抗原標(biāo)簽和載體材料對(duì)篩選效率的影響

 

在篩選過程中，可能會(huì)篩選出針對(duì)抗原上所有物質(zhì)的共軛物，如抗原標(biāo)簽、融合蛋白和載體材料。為了克服這個(gè)問題，通�？梢允褂冕槍�(duì)非目標(biāo)的負(fù)篩選來限制針對(duì)目標(biāo)抗原以外的抗體的富集。例如，在使用鏈霉親和素磁珠篩選生物素化蛋白質(zhì)之前，可將文庫與鏈霉親和素磁珠和生物素化非目標(biāo)蛋白質(zhì)預(yù)結(jié)合，以減少這類不需要的結(jié)合物的比例。

 

四．如何去除復(fù)雜的抗原混合物

 

對(duì)于未知或復(fù)雜的目標(biāo)分子，如全細(xì)胞或不純蛋白質(zhì)，可進(jìn)行嚴(yán)格的負(fù)向篩選。例如，在事先不了解目標(biāo)蛋白，但非目標(biāo)蛋白是已知的情況下對(duì)全細(xì)胞進(jìn)行負(fù)向篩選。在負(fù)向篩選過程中，噬菌體展示文庫首先與非目標(biāo)抗原對(duì)應(yīng)的重組蛋白孵育。然后將未結(jié)合的噬菌體轉(zhuǎn)移到目標(biāo)抗原上進(jìn)行篩選。

 

五．固相與液化抗原篩選法的選擇

 

當(dāng)抗體庫容量大、目標(biāo)抗體預(yù)期拷貝數(shù)高或親和力高、抗原來源豐富時(shí)，固化抗原篩選法可靠易用，有利于獲得高親和力、高特異性的抗體。當(dāng)預(yù)計(jì)目標(biāo)抗體較難獲得或固化抗原篩選不成功時(shí)，可采用生物素化抗原液相篩選法。當(dāng)篩選的目的是選擇高親和力抗體時(shí)，液相篩選法具有明顯的優(yōu)勢，尤其是解離率篩選更為高效、快速和可重復(fù)，是一種較為理想的手段。

 

六．文庫篩選的方法選擇

 

在第一種情況下，如果受體的結(jié)構(gòu)特性已知，并且可以方便地獲得受體的線性中和區(qū)或多肽片段，那么就可以使用經(jīng)典篩選策略或高通量篩選。這種策略簡單易行，可以篩選出具有高親和力的抗體，但有可能抗體與天然受體沒有任何結(jié)合活性。第二種情況是，如果受體的結(jié)構(gòu)特性已知，但沒有純化的蛋白質(zhì)，則可采用全細(xì)胞優(yōu)化篩選策略或高通量篩選。第三種情況是受體未知，使用適當(dāng)?shù)年幮约?xì)胞來屏蔽共有抗原，然后篩選靶細(xì)胞以獲得特異性抗體。

 

七．抗原的包被方式

 

 

直接包被與間接包被示意圖

 

 

 

包被形式	直接包被	間接包被
包被方法	抗原通過物理吸附直接固定在固相介質(zhì)表面，蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合，主要靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，因此疏水氨基酸豐富的區(qū)域更容易吸附。	利用固相載體表面的捕獲分子來固定抗原。（1）利用鏈霉親和素和生物素之間的強(qiáng)共價(jià)反應(yīng)，使抗原間接且穩(wěn)定地附著在固相載體表面。生物素化有兩種不同的策略：定點(diǎn)生物素化和隨機(jī)生物素化。定點(diǎn)生物素化可利用Avi Tag實(shí)現(xiàn)體內(nèi)/體外生物素化。（2）利用不同的肽標(biāo)簽和標(biāo)記特異性捕獲分子來實(shí)現(xiàn)抗原的間接固定。（3）對(duì)于小分子抗原如多肽，可將小分子與載體蛋白如KLH，BSA，OVA等偶聯(lián)，用于抗原的呈遞，讓小分子充分的暴露。其次也可以將小分子與FC，GST，MBP融合表達(dá)，然后固定于介質(zhì)表面

  

八．結(jié)合篩選法的使用

 

在噬菌體抗體庫的篩選過程中，會(huì)存在一些非特異性結(jié)合，如果一直使用單一篩選方法，這些非特異結(jié)合的噬菌體也同樣被解離和擴(kuò)增，從而被保留下來。采用幾種淘選方法結(jié)合使用，如固相和液相結(jié)合的輪換淘洗法，可以有效地避免一些非特異性吸附。

 

九．解離條件的優(yōu)化

 

當(dāng)結(jié)合的噬菌體抗體被解離下以后，只顯示中或低親和力，影響特異性抗體的富集和篩選，需要對(duì)解離過程進(jìn)行了優(yōu)化。如在最后一輪篩選中逐步提高解離液的pH值；用靶蛋白溶液作為解離液來競爭解離噬菌體抗體；交替解離法等。