ChIP-seq等揭示人畜共患寄生蟲弓形蟲的蛋白質乳酸化和代謝調控機制

弓形蟲（Toxoplasma gondii）是弓形蟲�。╰oxoplasmosis）廣泛傳播的寄生蟲病的病原體之一，但其生物學特性仍然知之甚少。乳酸（Lactate）作為葡萄糖代謝的產物，不僅在包括弓形蟲在內的多種生物體中作為能量來源，還是一種參與基因激活和蛋白質功能的調控分子。賴氨酸乳酸化（Lysine lactylation, Kla）是一種與染色質重塑相關的翻譯后修飾（Posttranslational modifications，PTM），然而在弓形蟲中，組蛋白和非組蛋白的Kla尚未被研究。

2022年10月7日，沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院尹德琦博士等為第一作者、沈陽農業(yè)大學陳啟軍教授為通訊作者以“Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii ”為題在《Genomics, Proteomics & Bioinformatics》雜志發(fā)表研究論文，文章通過染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）等實驗首次對弓形蟲乳酸進行了全面分析，并對Kla的調控潛力進行了深入剖析，為闡明弓形蟲生物學特性和尋找新的殺蟲靶標開辟了新的途徑。
 

標題：Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii（人畜共患寄生蟲弓形蟲的蛋白質乳酸化和代謝調控）

時間：2022-10-7

期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics

影響因子：IF 9.5

技術平臺：ChIP-seq等

研究摘要：
為分析乳酸化在弓形蟲寄生蟲中的發(fā)生率和功能，研究人員繪制了速殖子增殖細胞的乳酸化組圖譜，并在弓形蟲RH株系中955種蛋白質上鑒定出1964個乳酸化位點。乳酸化蛋白質分布在多個亞細胞區(qū)域，并與多種生物過程密切相關，包括mRNA剪接、糖酵解、氨�；�-tRNA生物合成、RNA轉運以及許多信號通路。研究人員還使用特異性乳酸化抗體進行了染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析，分析結果表明組蛋白H4K12la和H3K14la在基于微管運動和細胞侵襲相關的弓形蟲啟動子和外顯子區(qū)域富集。進一步驗證了組蛋白去乙�；�酶TgHDACs 2、3和4的去乳酸化活性。同時，研究還表明使用抗組蛋白乙酰轉移酶（TgMYST-A）抗體處理顯著降低了弓形體中的蛋白質乳酸化。本研究提供了首個全球乳酸化蛋白質組數(shù)據集，并為進一步解析弓形蟲的功能生物學提供了基礎。

研究結果

（1）弓形蟲RH蛋白質組中Kla的鑒定

圖1：western blotting、免疫熒光分析（IFA）和液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）分析揭示弓形蟲中廣泛存在乳酸化。

1. 用抗乳糜蛋白酶抗體（anti-lactyllysine antibody）對速殖子裂解物（20μg）的SDS-PAGE和western blotting分析。
2. 弓形蟲RH速殖子與抗乳糜蛋白酶抗體的IFA分析（綠色）。陰性對照抗體是正常的兔IgG。細胞核用DAPI（藍色）染色。
3. 使用抗乳糜蛋白酶抗體的弓形蟲ME49的速殖子IFA分析（綠色）。陰性對照抗體是正常的兔IgG。細胞核用DAPI（藍色）染色。
4. 賴氨酸乳酸化的LC-MS/MS數(shù)據。
5. 維恩圖顯示了從三次重復中獲得的乳酸化蛋白質重疊部分。
6. 維恩圖顯示了從三次重復中獲得的乳酸化位點重疊部分。Kla，賴氨酸乳酸化；LC-MS/MS，液相色譜-串聯(lián)質譜法；IFA，免疫熒光分析；T.gondii，弓形蟲；SDS-PAGE，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；IgG，免疫球蛋白G；DAPI，4’，6-二脒基-2-苯基吲哚。

（2）乳酸化蛋白廣泛分布于弓形蟲的多個亞細胞區(qū)室中

圖2：乳酸化蛋白分布在多個亞細胞區(qū)室中，并參與多種生物功能。

1. 已鑒定的乳酸化蛋白的亞細胞分布。
2. 乳酸化蛋白的KEGG富集分析（Fisher精確檢驗，P<0.05）。
3. 使用KOG數(shù)據庫進行乳酸化蛋白的功能分類。橫軸表示KOG類別，縱軸表示蛋白數(shù)量。

使D. 用Motif-x生成由靶向賴氨酸殘基周圍的20個殘基組成的乳酸化位點的概率序列motif。每個字母的大小對應于該氨基酸殘基出現(xiàn)在該位點的頻率。

E. 熱圖顯示乳酸化賴氨酸周圍氨基酸出現(xiàn)的高（紅色）或低（綠色）頻率。紅框表示在修飾位點附近出現(xiàn)頻率更高的氨基酸，綠框表示修飾位點附近的氨基酸頻率較低。KEGG，京都基因和基因組百科全書；DC，差分；KOG，真核生物同源基因組。

（3）組蛋白乳酸化在弓形蟲中得到深刻鑒定

圖3：多個PTM發(fā)生在相同的組蛋白位點。

這些數(shù)字表示組蛋白上修飾位點的具體位置。不同顏色的橢圓表示不同類型的PTM。不同顏色的框表示不同的域。水平淺藍色線描述了介導PPI或生物過程的區(qū)域（氨基酸）的特征（來自通用蛋白質資源數(shù)據庫的特定信息)。PTM，蛋白翻譯修飾；PPI，蛋白-蛋白互作。
 

圖4：弓形蟲H4K12和H3K14被鑒定為組蛋白乳酸化位點。

1. 組蛋白H4K12la和H3K14la的western blotting分析。
2. 組蛋白H4K12la和H3K14la在寄生蟲細胞內和細胞外階段的間接IFA分析。兔IgG作為陰性對照。

C-D. 弓形蟲的組蛋白H4K12la和H3K14la的MS/MS譜。a和b離子是指肽的N-末端部分，y離子是指多肽的C-末端部分。

E. 組蛋白乳酸化位點（H4K12la和H3K14la）在染色體上的結合區(qū)分布circos圖。最外圈顯示染色體，內圈顯示每個樣本的分布趨勢。數(shù)據代表三個生物學重復。

F. H4K12la和H3K14la peaks在全基因組中的重疊分布。圈條長度表示富集程度，圓圈內的位置對應于peaks位置。ChIP-seq，染色質免疫沉淀測序。

（4）磷酸果糖激酶II（PFKII）是乳酸化的重要調控因子

圖5：抗TgPFKII抗體降低了蛋白質乳酸化。

1. 通過western blotting驗證純化的重組蛋白TgPFKII。
2. 弓形蟲RH和ME49中TgPFKII表達水平（131kDa）的western blotting分析。β-肌動蛋白用于歸一化。數(shù)據以三個生物重復的平均值±標準差表示（*，P<0.05；**，P<0.01；Student t檢驗）。
3. 用抗PFKII抗體免疫沉淀源自弓形蟲RH和ME49的可溶性蛋白，并用抗PFKII抗體檢測沉淀的PFKII蛋白（箭頭指示）。
4. 通過IFA分析不同濃度的陰性IgG（小鼠IgG）對蛋白質乳酸化（綠色）沒有影響。
5. 抗TgPFKII抗體以濃度依賴性方式抑制蛋白質乳酸化（綠色）。
6. 分別對用抗PFKII抗體和陰性對照抗體處理的組進行免疫熒光強度統(tǒng)計分析。采用Student t檢驗進行統(tǒng)計學顯著性分析。所有數(shù)據均顯示為平均值±標準差（N>10）。***，與對照組相比P＜0.001。
7. western blotting檢測不同濃度的抗PFKII抗體對弓形蟲RH乳酸化水平的影響。β-肌動蛋白用于歸一化。IP，免疫沉淀；PFKII，磷酸果糖激酶。

（5）組蛋白去乙�；�酶（HDAC）和乙酰轉移酶抗體對其酶活性產生顯著影響

圖6：與蛋白質乳酸化相關的TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的功能初步分析。

1. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDLC4和TgMYST-A的序列特征。
2. 特異性抗體對TgHDAC2（71 kDa）、TgHDAC3（53 kDa）、TgHDAC4（101 kDa）和TgMYST-A（56 kDa）的表達進行western blotting分析。
3. TgHDAC2、TgHDAC3、TgHDAC4和TgMYST-A的間接IFA分析（共定位）。
4. 特異性抗體對PTM影響的流程圖。
5. 抗TgHDAC2、抗TgHDLAC3、抗Tg HDAC4和抗TgMYST-A抗體對弓形蟲的乳酸化、2-羥基異丁�；�、巴豆�；�和乙酰化的調控。用箭頭指示修飾水平變化的蛋白。β-肌動蛋白用于歸一化。

HDAC2、HADC3和HDAC4是組蛋白去乙�；�酶；MYST-A是一種組蛋白賴氨酸乙酰轉移酶。

研究小結
研究總結了TF相關蛋白、RNA聚合酶相關蛋白、DBP和RBP中的乳酸化蛋白，發(fā)現(xiàn)它們與一系列過程有關，包括基因轉錄、RNA剪接、蛋白質翻譯和加工（圖7）。在弓形蟲中總共鑒定出23個TF、7個RNA聚合酶、6個DBP和27個RBP，分別具有49、8、8和62個Kla位點。

總之，本研究建立了第一個人畜共患寄生蟲弓形蟲蛋白質乳酸化的綜合圖譜，并揭示了乳酸化在寄生蟲的各種生物過程中深刻調控與能量代謝和基因激活相關的蛋白質。這些數(shù)據為開發(fā)抗寄生蟲藥物提供了新的途徑。

圖7：乳酸化參與基因調控示意圖。

示意圖顯示乳酸化蛋白，如轉錄因子蛋白、RNA聚合酶相關蛋白、DBP和RBP，參與轉錄和翻譯調控過程。藍框內的字體表明，乳酸化RBPs可能在不同細胞的各種轉錄后過程中發(fā)揮廣泛作用。在細胞核中將前體mRNA剪接成成熟mRNA的過程中，乳酸化的RBPs和剪接因子是主要的參與者。此外，乳酸化的RBPs可以幫助mRNA在核糖體中翻譯成蛋白質，一些RBPs可能被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。DBP，DNA結合蛋白；UPS，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)；RBP、RNA結合蛋白。

參考文獻：
Yin D, Jiang N, Cheng C, Sang X, Feng Y, Chen R, Chen Q. Protein Lactylation and Metabolic Regulation of the Zoonotic Parasite Toxoplasma gondii. Genomics Proteomics Bioinformatics. 2022 Oct 7. pii: S1672-0229(22)00126-7. doi: 10.1016/j.gpb.2022.09.010. PubMed PMID: 36216028.