液相篩選原理及常用方法介紹

一．文庫(kù)液相篩選原理

該方法是采用液相介質(zhì)。首先利用生物素標(biāo)記的抗原在溶液中結(jié)合表面呈現(xiàn)功能抗體的重組噬菌體，再利用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖或親和素偶聯(lián)的磁珠來(lái)捕獲與利用生物素標(biāo)記的抗原結(jié)合的重組噬菌體，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗體庫(kù)中功能抗體的富集；通過(guò)改變抗原濃度，結(jié)合-洗脫時(shí)間，能篩選得到高親和力的抗體；或選擇合理的篩選程序，如利用競(jìng)爭(zhēng)二抗，去除無(wú)關(guān)噬菌體抗體，篩選針對(duì)特異表位的抗體。

二．液相篩選優(yōu)點(diǎn)

（1）篩選效率高，增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的機(jī)會(huì)，能有效地將低拷貝數(shù)或低親和力的抗體從文庫(kù)中分離出來(lái)；

（2）解決了凝固后抗原表位被破壞的問(wèn)題；

（3）可根據(jù)文庫(kù)容量、抗原相對(duì)分子質(zhì)量和純度等靈活調(diào)整篩選系統(tǒng)；

（4）可在一定程度上預(yù)先確定所需的抗體親和力。可根據(jù)文庫(kù)容量、抗原相對(duì)分子質(zhì)量和純度等靈活調(diào)整篩選系統(tǒng)；

（5）所需抗體的親和力可在一定程度上預(yù)先確定。

三．液相篩選優(yōu)劣勢(shì)對(duì)比

優(yōu)勢(shì)：
在液相中，抗原和噬菌體抗體都可以自由地運(yùn)動(dòng)，抗原與噬菌體抗體碰撞、繼而結(jié)合的概率將大大增加；其次，抗原可以保持其空間構(gòu)象，并且噬菌體抗體可以結(jié)合抗原所有的表位，而在固相篩選中，抗原有可能因吸附在固相介質(zhì)上而導(dǎo)致部分表位的丟失。

劣勢(shì)：
生物素化的過(guò)程可能會(huì)破壞抗原表位，導(dǎo)致抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)的失活；固相上的鏈霉素容易引起非特異吸附等。
  

四．液相篩選常用方法

磁珠篩選：磁珠純化蛋白的原理是利用磁性珠子表面的親和基團(tuán)與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合，將目標(biāo)蛋白質(zhì)從混合物中分離出來(lái)。磁性珠子通常是由磁性材料和親和基團(tuán)組成的，親和基團(tuán)可以是金屬離子、抗體、酶、核酸等。當(dāng)混合物中存在目標(biāo)蛋白質(zhì)時(shí)，磁性珠子上的親和基團(tuán)與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成磁珠蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后，通過(guò)磁場(chǎng)的作用，將磁珠蛋白質(zhì)復(fù)合物集中在一起，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化。

五．磁珠篩選步驟

使用Tris-HCl-Tween緩沖液（TBST）洗滌親和素標(biāo)記的磁珠，用BSA封閉備用。

(1) 包被磁珠：用1nmol生物素化抗原和1nmol游離生物素分別與500µL封閉后的磁珠在室溫下孵育1小時(shí)。使用磁性架將磁珠吸附在上面，去除上清，再用TBST洗滌后重懸于含1%BSA的TBS中。

(2) 負(fù)向篩選：在生物素包被的磁珠中加入1mL擴(kuò)增好的噬菌體抗體庫(kù)，在室溫下孵育1小時(shí)。再用磁性架吸附磁珠。

(3) 抗原篩選：就上述得到的上清移入生物素化的抗原磁珠中，在室溫下孵育1小時(shí)，再用磁性架吸附磁珠，去掉上清。TBST洗滌10次，去掉上清。

(4) 洗脫：加入250µL 10µg/mL胰蛋白酶，混勻30min。

(5) 取120µL洗脫的噬菌體加入到1.5mLTG1中，在37℃條件下水浴30min，離心后加200µL TES緩沖液，均勻涂布在TYE-A-G平板上，剩余的加甘油保存。

(6) 次級(jí)庫(kù)的制備：次日洗下菌苔接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，向其中加入輔助噬菌體KM13，侵染30min后，重懸沉淀物，在37℃培養(yǎng)1h后加卡那霉素至終濃度為50µg/mL，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日離心后，將上清倒至遇冷的PEG/NaCl中沉淀噬菌體，制備出次級(jí)庫(kù)。

六．蛋白偶聯(lián)步驟

計(jì)算需要偶聯(lián)的蛋白，抗體量一般每毫克活化的羧基磁珠可以偶聯(lián)20-500ug的蛋白（抗體）�？蛇m量添加一些載體蛋白，如BSA Fraction V，增加反應(yīng)體系中的總蛋白量，從而可以起到一定的封閉作用。保證抗體偶聯(lián)的正確方向。

(1) 將蛋白加至5mL MES緩沖液中，（吸取50μL蛋白液于950μL的MES緩沖中，配成1: 20的稀釋液標(biāo)記為偶聯(lián)反應(yīng)前蛋白液，置于一旁用于后面的偶聯(lián)率計(jì)算。

(2) 將剩下的蛋白液加到裝有活化磁珠的離心管內(nèi)，劇烈振蕩混勻，室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上偶聯(lián)反應(yīng)16-24小時(shí)。（將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心收集上清，標(biāo)記為偶聯(lián)后蛋白液，用于計(jì)算偶聯(lián)率。

(3) 重懸磁珠于5mLMES緩沖液中，振蕩搖勻。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。

(4) 重復(fù)步驟（3），重復(fù)加5mL的淬滅液，振蕩搖勻，室溫下，將離心管置于旋轉(zhuǎn)混勻儀上30分鐘。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。

七．優(yōu)化液相篩選方案

可以將固定化金屬親和層析（IMAC）技術(shù)引入到噬菌體抗體庫(kù)的篩選中，將純化的帶有His標(biāo)簽的抗原與噬菌體抗體庫(kù)混合，噬菌體抗體與抗原充分結(jié)合后再加入親和介質(zhì)，使噬菌體抗體抗原復(fù)合物通過(guò)His標(biāo)簽與介質(zhì)結(jié)合，然后通過(guò)充分洗滌去除非特異性噬菌體抗體，最后將特異性噬菌體抗體解離下來(lái)，感染TG1，在進(jìn)行下一輪篩選，是一種改進(jìn)的液相篩選方法。