單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在揭示光療通過腦膜淋巴系統(tǒng)改善AD和衰老中的應(yīng)用
2024年2月16日，海南大學(xué)周非凡教授和駱清銘院士為共同通訊在《nature communications》（自然通訊）雜志發(fā)表題為“Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice”的研究論文，研究利用近紅外激光（808 nm）對衰老及阿爾茨海默�。ˋlzheimer's disease, AD）小鼠進行無接觸經(jīng)顱光療，利用單細胞及微量轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq2）等分析揭示光療可以顯著提升腦膜淋巴系統(tǒng)的引流功能，從而實現(xiàn)小鼠的病理緩解及認知提升。
標題：Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice（腦膜淋巴管的非侵入性調(diào)控可改善小鼠的衰老和阿爾茨海默氏病相關(guān)的病理和認知提升）
時間：2024年2月16日
發(fā)表期刊：nature communications
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：單細胞及微量轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq2）等
研究背景：
2015年，位于硬腦膜的腦膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels，mLVs）被發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成了廣泛的淋巴引流網(wǎng)絡(luò)，以清除大分子廢物和炎癥介質(zhì)，直接免疫細胞轉(zhuǎn)運，并協(xié)調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的免疫反應(yīng)。
阿爾茨海默�。ˋD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，死亡率很高。AD的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）異常聚集和大腦中的神經(jīng)元纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和認知能力下降。MLV 隨著年齡增長或 AD 進展而功能退化，這可能是認知功能障礙和神經(jīng)損傷加劇的潛在因素。通過枕大池（intracisterna magna）內(nèi)注射病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）治療可以有效增強mLVs功能，進而增強淋巴引流以清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的有毒分子，并提高學(xué)習(xí)和記憶能力。因此，mLV可能是與年齡相關(guān)認知缺陷的治療靶點。然而，對于如AD等慢性和進行性神經(jīng)退行性疾病，侵入性治療模式并不可行。因此，開發(fā)非侵入性治療方式對于AD治療非常必要。
mLVs 網(wǎng)絡(luò)淺表分布在硬腦膜中，這為經(jīng)顱神經(jīng)調(diào)控治療提供了一種很有前途的策略，通過 mLVs 引流調(diào)控來緩解 CNS 疾病。本研究基于組織穿透的光學(xué)窗口，證明了近紅外光可以調(diào)控腦膜淋巴內(nèi)皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）功能，同時又促進mLVs引流，以緩解病理學(xué)并增強老年和AD小鼠的認知功能。本研究結(jié)果表明，光對mLECs線粒體代謝穩(wěn)態(tài)的增強可以促進細胞粘附和生長，這可能增強細胞功能和mLECs連接，以進一步促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的腦膜淋巴轉(zhuǎn)運以改善病理。
研究摘要：
腦膜淋巴管（MLV）參與淀粉樣蛋白β（Aβ）的清除，被認為是阿爾茨海默�。ˋD）的潛在治療靶點。本研究基于MLV的表層空間分布，采用近紅外光調(diào)節(jié)淋巴引流，顯著改善老年小鼠和AD（5xFAD和APP/PS1）小鼠的認知，并通過減少aβ沉積、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷等來改善AD相關(guān)病理。此外透射電子顯微鏡成像和RNA測序（Smart-seq2）數(shù)據(jù)表明，通過光調(diào)節(jié)改善了腦膜淋巴管內(nèi)皮細胞（MLEC）的線粒體代謝和細胞連接。這些研究共同表明，近紅外光治療可以通過恢復(fù)mLEC功能來增強MLV清除能力，從而改善認知功能。總之，光的淋巴引流增強促進了衰老和AD小鼠模型的病理緩解和認知增強，為神經(jīng)退行性疾病提供了潛在的改善策略。
mLVs靶向光療改善AD病理的機制示意圖
近紅外光通過光感受器CcO增強MLEC中的線粒體代謝，CcO修復(fù)淋巴細胞連接并安排恢復(fù)MLV引流，促進廢物大分子（Aβ）清除，最終緩解小鼠神經(jīng)退行性過程。
研究結(jié)果：
（1）光調(diào)節(jié) mLVs 引流并改善老年小鼠的認知能力下降：15-17個月的老年C57BL/6J小鼠實驗確定近紅外光療最佳劑量和改善認知療效
（2）光調(diào)節(jié)減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷：6個月的5xFAD小鼠和11個月的APPswe/PS1ΔE9小鼠實驗證實近紅外光療可減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷。
從海馬體（hippocampus，HPC）組織中提取總RNA并測序（圖2r、s，補充圖6）：
圖2：光對AD小鼠認知和病理學(xué)的改善作用。
補充圖6：光對5xFAD小鼠海馬體相關(guān)基因表達的改善效果。
a-b. 火山圖（a）和熱圖（b）顯示了光處理組與5xFAD組之間海馬體差異表達基因（DEGs）的上調(diào)和下調(diào)。
c. 熱圖顯示參與神經(jīng)發(fā)生調(diào)控的DEGs的相對表達水平。
d. 比較組間海馬體組織DEGs 的KEGG富集分析。
e. 熱圖顯示參與TGF-beta信號通路的DEGs的相對表達水平。a-e數(shù)據(jù)中每組有4只小鼠。
（3）光對mLV結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)增強了mLV引流
（4）促進mLVs引流是光改善認知的必要條件
（5）腦膜淋巴內(nèi)皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）的線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞功能受光調(diào)節(jié)
從腦膜組織中提取總RNA并測序（圖5c-g，補充圖11）
b. mLECs線粒體長度的定量分析。每組n = 4只小鼠。
c. 光處理AD組和AD組腦膜中Nckap1l、Nck1、Calm2、Cdc42和Vegfc的表達水平。
d. 通過基因集富集分析（GSEA）的Hallmark基因組富集圖，顯示運行富集評分的輪廓和基因集成員在排序表位置。
e. 散點圖顯示線粒體氧化磷酸化富集基因，并根據(jù)Log2(FC)（FC：倍數(shù)變化）排序。
f. 光處理AD組和AD組mLECs中Lyve1、Prox1、Pecam1和Tgfa的表達。
g. 熱圖顯示參與線粒體代謝的mLECs中DEGs的相對表達水平。
每組數(shù)據(jù)n=3只小鼠（數(shù)據(jù)c-g）。b、c、f中的數(shù)據(jù)均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較（b），或雙尾未配對Student's t-test進行兩組比較（c, f）。
b. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
c. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。
d. 老年小鼠用LYVE-1、MitoSOX和TMRE染色的mLVs代表性圖像（2個生物學(xué)重復(fù)）。比例尺= 10μm。
e. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
f. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。b、c、e、f數(shù)據(jù)中每組n=4只小鼠。
g-h. 火山圖（g）和熱圖（h）顯示了與假手術(shù)組相比，接受光治療的5xFAD小鼠腦膜中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因（DEGs）。顏色比例尺值代表跨樣本的標準化對數(shù)值。
i. 相似性矩陣展示了上調(diào)的GO生物過程聚類，右側(cè)詞云包含顯著GO的過表達關(guān)鍵詞。
j-l. 比較光處理5xFAD組與5xFAD組腦膜中所有DEGs（j）、上調(diào)DEGs（k）和下調(diào)DEGs（l）的KEGG功能富集分析，通過Log10(P值)衡量。g-l數(shù)據(jù)中每組n=3只小鼠。b、c、e、f中的數(shù)據(jù)均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較。
從腦膜中分離出mLEC進行RNA-seq分析（補充圖12）
b-c. 5xFAD組與野生型（WT）組（b）、光處理5xFAD組與5xFAD組（c）之間mLECs的差異表達基因（DEGs）火山圖。
d-e. 5xFAD組與WT組（d）、光處理5xFAD組與5xFAD組（e）mLECs的DEGs熱圖。
f-g. 5xFAD組與WT組之間下調(diào)基因（f）、光處理5xFAD組與5xFAD組上調(diào)基因（g）的KEGG功能富集分析。
數(shù)據(jù)a-g中，WT組n=4只小鼠，5xFAD組和光處理5xFAD組n = 3只小鼠。
參考文獻：Wang M, Yan C, Li X, Yang T, Wu S, Liu Q, Luo Q, Zhou F. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 2024 Feb 16;15(1):1453. pii: 10.1038/s41467-024-45656-7. doi: 10.1038/s41467-024-45656-7. PubMed PMID: 38365740.
標題：Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer’s disease-associated pathology and cognition in mice（腦膜淋巴管的非侵入性調(diào)控可改善小鼠的衰老和阿爾茨海默氏病相關(guān)的病理和認知提升）
時間：2024年2月16日
發(fā)表期刊：nature communications
影響因子：IF 16.6 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：單細胞及微量轉(zhuǎn)錄組測序（Smart-seq2）等
研究背景：
2015年，位于硬腦膜的腦膜淋巴管（meningeal lymphatic vessels，mLVs）被發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成了廣泛的淋巴引流網(wǎng)絡(luò)，以清除大分子廢物和炎癥介質(zhì)，直接免疫細胞轉(zhuǎn)運，并協(xié)調(diào)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的免疫反應(yīng)。
阿爾茨海默�。ˋD）是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，死亡率很高。AD的主要病理特征是β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）異常聚集和大腦中的神經(jīng)元纏結(jié)，導(dǎo)致神經(jīng)元功能障礙和認知能力下降。MLV 隨著年齡增長或 AD 進展而功能退化，這可能是認知功能障礙和神經(jīng)損傷加劇的潛在因素。通過枕大池（intracisterna magna）內(nèi)注射病毒介導(dǎo)的血管內(nèi)皮生長因子C（VEGF-C）治療可以有效增強mLVs功能，進而增強淋巴引流以清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的有毒分子，并提高學(xué)習(xí)和記憶能力。因此，mLV可能是與年齡相關(guān)認知缺陷的治療靶點。然而，對于如AD等慢性和進行性神經(jīng)退行性疾病，侵入性治療模式并不可行。因此，開發(fā)非侵入性治療方式對于AD治療非常必要。
mLVs 網(wǎng)絡(luò)淺表分布在硬腦膜中，這為經(jīng)顱神經(jīng)調(diào)控治療提供了一種很有前途的策略，通過 mLVs 引流調(diào)控來緩解 CNS 疾病。本研究基于組織穿透的光學(xué)窗口，證明了近紅外光可以調(diào)控腦膜淋巴內(nèi)皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）功能，同時又促進mLVs引流，以緩解病理學(xué)并增強老年和AD小鼠的認知功能。本研究結(jié)果表明，光對mLECs線粒體代謝穩(wěn)態(tài)的增強可以促進細胞粘附和生長，這可能增強細胞功能和mLECs連接，以進一步促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的腦膜淋巴轉(zhuǎn)運以改善病理。
研究摘要：
腦膜淋巴管（MLV）參與淀粉樣蛋白β（Aβ）的清除，被認為是阿爾茨海默�。ˋD）的潛在治療靶點。本研究基于MLV的表層空間分布，采用近紅外光調(diào)節(jié)淋巴引流，顯著改善老年小鼠和AD（5xFAD和APP/PS1）小鼠的認知，并通過減少aβ沉積、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元損傷等來改善AD相關(guān)病理。此外透射電子顯微鏡成像和RNA測序（Smart-seq2）數(shù)據(jù)表明，通過光調(diào)節(jié)改善了腦膜淋巴管內(nèi)皮細胞（MLEC）的線粒體代謝和細胞連接。這些研究共同表明，近紅外光治療可以通過恢復(fù)mLEC功能來增強MLV清除能力，從而改善認知功能。總之，光的淋巴引流增強促進了衰老和AD小鼠模型的病理緩解和認知增強，為神經(jīng)退行性疾病提供了潛在的改善策略。
mLVs靶向光療改善AD病理的機制示意圖
研究結(jié)果：
（1）光調(diào)節(jié) mLVs 引流并改善老年小鼠的認知能力下降：15-17個月的老年C57BL/6J小鼠實驗確定近紅外光療最佳劑量和改善認知療效
圖1：光對老年小鼠認知和mLVs引流的影響
（2）光調(diào)節(jié)減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷：6個月的5xFAD小鼠和11個月的APPswe/PS1ΔE9小鼠實驗證實近紅外光療可減輕AD小鼠的認知能力下降和病理損傷。
從海馬體（hippocampus，HPC）組織中提取總RNA并測序（圖2r、s，補充圖6）：
圖2：光對AD小鼠認知和病理學(xué)的改善作用。
補充圖6：光對5xFAD小鼠海馬體相關(guān)基因表達的改善效果。
a-b. 火山圖（a）和熱圖（b）顯示了光處理組與5xFAD組之間海馬體差異表達基因（DEGs）的上調(diào)和下調(diào)。
c. 熱圖顯示參與神經(jīng)發(fā)生調(diào)控的DEGs的相對表達水平。
d. 比較組間海馬體組織DEGs 的KEGG富集分析。
e. 熱圖顯示參與TGF-beta信號通路的DEGs的相對表達水平。a-e數(shù)據(jù)中每組有4只小鼠。
（3）光對mLV結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)增強了mLV引流
圖3：光對5xFAD小鼠mLV引流功能和結(jié)構(gòu)變化的改善作用。
（4）促進mLVs引流是光改善認知的必要條件
圖4：光對mLVs消融小鼠認知和淋巴引流的影響
（5）腦膜淋巴內(nèi)皮細胞（meningeal lymphatic endothelial cells，mLEC）的線粒體穩(wěn)態(tài)和細胞功能受光調(diào)節(jié)
從腦膜組織中提取總RNA并測序（圖5c-g，補充圖11）
圖5：光對5xFAD小鼠mLVs微觀結(jié)構(gòu)和基因表達的改善作用
a. mLEC排列和線粒體形態(tài)的代表性透射電子顯微鏡（TEM）圖像（紅色箭頭：mLEC的線粒體）（2個重復(fù)）。比例尺= 2μm、500nm或200nm。b. mLECs線粒體長度的定量分析。每組n = 4只小鼠。
c. 光處理AD組和AD組腦膜中Nckap1l、Nck1、Calm2、Cdc42和Vegfc的表達水平。
d. 通過基因集富集分析（GSEA）的Hallmark基因組富集圖，顯示運行富集評分的輪廓和基因集成員在排序表位置。
e. 散點圖顯示線粒體氧化磷酸化富集基因，并根據(jù)Log2(FC)（FC：倍數(shù)變化）排序。
f. 光處理AD組和AD組mLECs中Lyve1、Prox1、Pecam1和Tgfa的表達。
g. 熱圖顯示參與線粒體代謝的mLECs中DEGs的相對表達水平。
每組數(shù)據(jù)n=3只小鼠（數(shù)據(jù)c-g）。b、c、f中的數(shù)據(jù)均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較（b），或雙尾未配對Student's t-test進行兩組比較（c, f）。
補充圖11：光對5xFAD小鼠腦膜基因表達的改善效果。
a. 5xFAD小鼠用LYVE-1、線粒體超氧化物指示劑（MitoSOX）和四甲基羅丹明（TMRE）染色的mLVs代表性圖像（2個生物學(xué)重復(fù)）。比例尺 = 10μm。b. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
c. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。
d. 老年小鼠用LYVE-1、MitoSOX和TMRE染色的mLVs代表性圖像（2個生物學(xué)重復(fù)）。比例尺= 10μm。
e. 通過MitoSOX熒光定量檢測mLECs中線粒體超氧化物。
f. 通過TMRE熒光定量檢測mLECs中線粒體膜電位。b、c、e、f數(shù)據(jù)中每組n=4只小鼠。
g-h. 火山圖（g）和熱圖（h）顯示了與假手術(shù)組相比，接受光治療的5xFAD小鼠腦膜中上調(diào)和下調(diào)的差異表達基因（DEGs）。顏色比例尺值代表跨樣本的標準化對數(shù)值。
i. 相似性矩陣展示了上調(diào)的GO生物過程聚類，右側(cè)詞云包含顯著GO的過表達關(guān)鍵詞。
j-l. 比較光處理5xFAD組與5xFAD組腦膜中所有DEGs（j）、上調(diào)DEGs（k）和下調(diào)DEGs（l）的KEGG功能富集分析，通過Log10(P值)衡量。g-l數(shù)據(jù)中每組n=3只小鼠。b、c、e、f中的數(shù)據(jù)均值±SEM，并通過單因素方差分析（ANOVA）與Sidak多重比較測試進行多組比較。
從腦膜中分離出mLEC進行RNA-seq分析（補充圖12）
補充圖12：光對5xFAD小鼠mLECs基因表達的改善效果。
a. 代表性圖表顯示通過熒光激活細胞分選（FACS）從不同組小鼠腦膜中分離mLECs的門控策略。b-c. 5xFAD組與野生型（WT）組（b）、光處理5xFAD組與5xFAD組（c）之間mLECs的差異表達基因（DEGs）火山圖。
d-e. 5xFAD組與WT組（d）、光處理5xFAD組與5xFAD組（e）mLECs的DEGs熱圖。
f-g. 5xFAD組與WT組之間下調(diào)基因（f）、光處理5xFAD組與5xFAD組上調(diào)基因（g）的KEGG功能富集分析。
數(shù)據(jù)a-g中，WT組n=4只小鼠，5xFAD組和光處理5xFAD組n = 3只小鼠。
參考文獻：Wang M, Yan C, Li X, Yang T, Wu S, Liu Q, Luo Q, Zhou F. Non-invasive modulation of meningeal lymphatics ameliorates ageing and Alzheimer's disease-associated pathology and cognition in mice. Nat Commun. 2024 Feb 16;15(1):1453. pii: 10.1038/s41467-024-45656-7. doi: 10.1038/s41467-024-45656-7. PubMed PMID: 38365740.
標簽：
DNA甲基化
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