基于亞硫酸鹽測序的交集時鐘揭示人類胚胎發(fā)生過程中年輕化事件
最近的研究揭示了小鼠的早期發(fā)育過程中的年輕化事件（rejuvenation event）。本文通過檢測人類胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳年齡動態(tài)變化，分析人類是否也存在類似事件。為此，研究人員開發(fā)了一種表觀遺傳時鐘方法——交集時鐘（intersection clock），該方法利用亞硫酸鹽測序，最大限度利用信息豐富的CpG位點，并確保檢測樣本中沒有缺失的時鐘CpG位點，將其應用于人類胚胎發(fā)育數(shù)據。分析結果表明，在卵裂期和囊胚期胚胎之間預測的表觀遺傳年齡沒有變化；然而在囊胚和代表外胚層的細胞之間觀察到表觀遺傳年齡顯著下降。通過將交集時鐘應用于跨越植入前和植入后的數(shù)據集，結果揭示了在植入前階段的表觀遺傳年齡沒有顯著變化；而植入后樣本的表觀遺傳年齡較低。進一步研究了primed（重編程細胞，早期植入后階段）和naïve（未重編程細胞，植入前階段）誘導多能干細胞（iPSCs）的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細胞。總的來說，本研究數(shù)據分析表明人類胚胎在早期胚胎發(fā)生過程中經歷了年輕化。因此，年輕化事件在小鼠和人類之間是保守的，且在兩個物種中都發(fā)生在原腸胚形成（gastrulation）階段。此外，本研究的交集時鐘為基于人類亞硫酸鹽測序數(shù)據集的其他表觀遺傳年齡研究開辟了道路。
背景
生殖細胞系在成年生活中會經歷與年齡相關的變化。有人提出，在受精后的后代中生殖細胞可能會經歷年輕化。研究人員基于這一想法進行基于數(shù)據的測試，應用表觀遺傳時鐘來追蹤生物年齡（即基于分子標記的年齡）的變化，并揭示了小鼠胚胎發(fā)生早期的年輕化事件。結果表明，胚胎第6.5/7.5天樣本的平均表觀遺傳年齡與胚胎發(fā)生早期階段相比始終較低，使用不同的概率時鐘（scAge）進行單細胞分析也顯示了類似模式。這個胚胎時期大約對應于原腸胚形成。然而，人類是否存在類似的年輕化事件仍然是一個未解的問題。為此，研究人員評估了人類早期胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳年齡動態(tài)變化。
表觀遺傳時鐘基于CpG位點的甲基化水平，是生物年齡的有前景的分子估計器。這些時鐘可以定量分析人類衰老的多個方面。盡管有多種基于人類甲基化陣列的表觀遺傳時鐘可用，但基于人類亞硫酸鹽測序的老化時鐘尚未開發(fā)。這可能是因為直到最近，還沒有可用的亞硫酸鹽測序數(shù)據（具有足夠數(shù)量的年齡metadata的樣本）適合用于訓練（training）表觀遺傳時鐘。
分析結果：
為了評估人類胚胎發(fā)生的表觀遺傳年齡動態(tài)變化，需要基于人類亞硫酸鹽測序數(shù)據的表觀遺傳時鐘方法，因為只有這種類型的數(shù)據對人類胚胎可用（表S1）。因此開發(fā)了一種新的表觀遺傳時鐘方法，即“交集時鐘”（圖1），并使用182個人類血液樣本的可用簡化還原性亞硫酸鹽測序（RRBS）數(shù)據進行訓練（表S1中的數(shù)據集1，圖S1）。交集時鐘針對亞硫酸鹽測序數(shù)據進行優(yōu)化，其中訓練集和測試數(shù)據集之間重疊的CpG位點數(shù)量不足，無法進行可靠預測。交集時鐘最大限度利用在測試樣本中沒有丟失時鐘CpG位點的信息性CpG位點。通過在訓練數(shù)據集和測試樣本數(shù)據之間的交集CpG位點上進行訓練和測試來預測測試樣本的年齡。因此，交集時鐘方法保證在測試樣本中沒有丟失的時鐘CpG位點。盡管這種方法需要為每個數(shù)據集訓練新的表觀遺傳時鐘，但它最大程度提高了這些數(shù)據集的效用。
表S1：本研究中使用的胚胎 DNA 甲基化數(shù)據集和樣本，從可用的數(shù)據集中選擇了人類RRBS/WGBS批量樣本。
DCM：擴張型心肌�。籈S細胞：胚胎干細胞；GW：妊娠周；HNES細胞：人類幼稚胚胎干細胞；iPSCs：誘導多能干細胞；MII卵母細胞：中期II卵母細胞；P：通道；PSCs：多能干細胞；RRBS：減少代表性亞硫酸鹽測序；WGBS：全基因組亞硫酸鹽測序。
圖1：交集時鐘工作流程示意圖。對每個測試樣本進行表觀遺傳年齡預測，工作流程如下：
補充圖S1：按條件、性別和年齡分列的182個訓練樣本（人類血液）的分布情況。
SA：自殺未遂者；MDD：重度抑郁癥。
為了評估胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳年齡動態(tài)變化，收集可用的人類DNA甲基化（DNAm）數(shù)據集（數(shù)據集2-4），并使用交集時鐘進行分析。交集時鐘對僅限于交集CpG位點訓練集上的交集驗證中表現(xiàn)出高性能（圖2a-c）。數(shù)據集2中的一項研究使用RRBS生成了人類植入前發(fā)育和胚胎干細胞（代表人類外胚層）的全基因組甲基化圖。研究人員處理了包括精子、卵裂、囊胚和人類胚胎干細胞（ES）細胞在內的所有人類樣本的甲基化水平，觀察到卵裂期和囊胚期胚胎的預測表觀遺傳年齡之間沒有顯著變化（p = 0.7378）；囊胚和ES細胞的表觀遺傳年齡顯著下降（p=1.582e-12）（圖2e）。小鼠外胚層（E6.5）與人類ES細胞之間的跨物種比較表明，這些ES細胞是人類外胚層的合理替代物；因此數(shù)據表明，人類植入后外胚層的表觀遺傳年齡也低于植入前階段的表觀遺傳年齡。進一步將交集時鐘應用于另外兩個數(shù)據集（數(shù)據集3和4），其中包含植入前（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚）和植入后（GW 6-11肝臟和絨毛）樣本。觀察到植入前階段之間沒有顯著變化；但植入后樣本的表觀遺傳年齡顯著下降（圖2f，g）�？偟膩碚f數(shù)據表明人類胚胎在早期胚胎發(fā)生期間年輕化。
圖2：交集時鐘揭示人類早期胚胎發(fā)生期間的年輕化事件。
(a-d、i、k、m) 交集CpG位點數(shù)量和交集驗證（CV）模型性能：圖表展示交集時鐘在不同數(shù)據集（Datasets2–8）上的交集CpG位點數(shù)量以及交集驗證模型的性能。性能通過Pearson相關系數(shù)（r）和平均絕對誤差中位數(shù)（MedAE）評估。每個點代表一個測試樣本，CV性能在交集CpG位點的訓練集（Dataset1）中分析。
(e-g) 不同人類發(fā)育階段樣本的平均預測年齡（表觀遺傳年齡）：圖表顯示交集時鐘對不同人類發(fā)育階段樣本（來自Datasets2–4）的平均預測年齡。在數(shù)據集2中，ES細胞代表植入后外胚層。
(h) 圖表展示交集時鐘對健康對照組和擴張型心肌病患者的纖維細胞及其衍生的誘導多能干細胞（iPSCs）（來自Dataset5）的平均預測年齡。
(j、l、n) 圖表展示交集時鐘對不同數(shù)據集（Datasets6–8）的naïve細胞（重置細胞、HNES1細胞）和primed（常規(guī)PSCs，primed HNES1細胞，代表植入后外胚層）胚胎干細胞（ESC）樣本的平均預測年齡（表觀遺傳年齡）。
為了進一步驗證該方法分析年輕化事件的能力，將交集時鐘應用于人類誘導多能干細胞（iPSCs）數(shù)據集（Dataset 5）。結果表明，成年對照組（p=0.0136）和擴張型心肌病患者（2.679e-05）的成纖維細胞重編程后，表觀遺傳年齡顯著下降（圖2d、h）。
數(shù)據集2-4不僅包含胚胎數(shù)據，還包括精子數(shù)據，在數(shù)據集3中還包括MII卵母細胞樣本。將交集時鐘應用于這些樣本的甲基化譜，發(fā)現(xiàn)精子細胞的表觀遺傳年齡在某些情況下低于植入前階段：在數(shù)據集2和3中的差異顯著（圖2e、f），而在數(shù)據集4中的差異不顯著（圖2g）。此外，人類MII卵母細胞和植入前胚胎之間的表觀遺傳年齡沒有顯著差異（圖2f），盡管精子細胞的表觀遺傳年齡顯著低于MII卵母細胞。目前尚不清楚雄性生殖細胞在配子發(fā)生過程中是否也會經歷年輕化。
無論是來源于囊胚還是通過重編程生成的常規(guī)人類多能干細胞（PSCs），都與小鼠胚胎干細胞不同，代表了多能性的發(fā)育晚期或啟動階段。通過體外重置常規(guī)PSCs或直接從ICM捕獲細胞開發(fā)了多種方法來生成更接近原始表型的PSCs。通過將交集時鐘應用于數(shù)據集6-8，primed（代表早期植入后）和naïve（代表植入前）PSCs的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細胞（圖2i-n）。
總之，這些數(shù)據支持了年輕化事件發(fā)生在人類早期胚胎發(fā)育期間的假設。
DISCUSSION
本研究結果重現(xiàn)了在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)胚胎第6.5/7.5天樣本的表觀遺傳年齡與早期胚胎發(fā)生階段相比始終較低。因此，胚胎年輕化事件在小鼠和人類之間保守，并且在兩個物種中都發(fā)生在胚胎發(fā)育的原腸胚形成階段。數(shù)據支持人類胚胎發(fā)生過程中實現(xiàn)對應于生物體最低生物學年齡的“歸零（ground zero）”模型。隨著對“ground zero”認識的不斷發(fā)展，可能會改變對人類生物體生命開始的看法。
在某些情況下，精子細胞的表觀遺傳年齡低于MII卵母細胞和植入前階段胚胎。本研究分析了胚胎年輕化，但目前尚不清楚生殖細胞發(fā)育和配子發(fā)生是否也與年輕化有關，需要進一步研究來闡明這一點。
在唯一可用的潛在訓練數(shù)據集（數(shù)據集1）中，最年長的健康患者是40歲，而年長患者表現(xiàn)出不良的健康表型（SA或MDD，圖S1）。盡管最初研究揭示了健康組與SA組、健康組與MDD組之間的甲基化譜存在顯著差異，但至少部分差異可能是由于健康組與SD/MDD組之間的平均年齡差異所致。同樣可能的是，區(qū)分健康組和SD/MDD組的CpG位點與表觀遺傳時鐘使用的CpG位點不同�？偟膩碚f，在這種情況下，使用所有數(shù)據進行訓練過程是合理的。
先前基于甲基化芯片的人類iPSCs表觀遺傳年齡評估顯示，在重編程過程中表觀遺傳年齡下降（即年輕化）。本研究基于人類亞硫酸鹽測序數(shù)據驗證了這些結果（圖2h），并表明交集時鐘可以檢測到年輕化。
人類胚胎的全基因組CpG甲基化在植入前發(fā)育期間從受精卵到囊胚階段逐漸減少，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中全基因組CpG甲基化增加。相比之下，植入前發(fā)育期間（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚階段；圖2e-g）表觀遺傳年齡沒有顯著變化，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中表觀遺傳年齡下降（圖2e-g、j、l、n）。這些數(shù)據表明，DNA甲基化維持和de novo甲基化在年輕化事件中發(fā)揮作用，和之前在小鼠中的結果一致。
參考文獻：
Kerepesi C, Gladyshev VN. Intersection clock reveals a rejuvenation event during human embryogenesis. Aging Cell. 2023 Oct;22(10):e13922. doi: 10.1111/acel.13922. PubMed PMID: 37786333.
背景
生殖細胞系在成年生活中會經歷與年齡相關的變化。有人提出，在受精后的后代中生殖細胞可能會經歷年輕化。研究人員基于這一想法進行基于數(shù)據的測試，應用表觀遺傳時鐘來追蹤生物年齡（即基于分子標記的年齡）的變化，并揭示了小鼠胚胎發(fā)生早期的年輕化事件。結果表明，胚胎第6.5/7.5天樣本的平均表觀遺傳年齡與胚胎發(fā)生早期階段相比始終較低，使用不同的概率時鐘（scAge）進行單細胞分析也顯示了類似模式。這個胚胎時期大約對應于原腸胚形成。然而，人類是否存在類似的年輕化事件仍然是一個未解的問題。為此，研究人員評估了人類早期胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳年齡動態(tài)變化。
表觀遺傳時鐘基于CpG位點的甲基化水平，是生物年齡的有前景的分子估計器。這些時鐘可以定量分析人類衰老的多個方面。盡管有多種基于人類甲基化陣列的表觀遺傳時鐘可用，但基于人類亞硫酸鹽測序的老化時鐘尚未開發(fā)。這可能是因為直到最近，還沒有可用的亞硫酸鹽測序數(shù)據（具有足夠數(shù)量的年齡metadata的樣本）適合用于訓練（training）表觀遺傳時鐘。
分析結果：
為了評估人類胚胎發(fā)生的表觀遺傳年齡動態(tài)變化，需要基于人類亞硫酸鹽測序數(shù)據的表觀遺傳時鐘方法，因為只有這種類型的數(shù)據對人類胚胎可用（表S1）。因此開發(fā)了一種新的表觀遺傳時鐘方法，即“交集時鐘”（圖1），并使用182個人類血液樣本的可用簡化還原性亞硫酸鹽測序（RRBS）數(shù)據進行訓練（表S1中的數(shù)據集1，圖S1）。交集時鐘針對亞硫酸鹽測序數(shù)據進行優(yōu)化，其中訓練集和測試數(shù)據集之間重疊的CpG位點數(shù)量不足，無法進行可靠預測。交集時鐘最大限度利用在測試樣本中沒有丟失時鐘CpG位點的信息性CpG位點。通過在訓練數(shù)據集和測試樣本數(shù)據之間的交集CpG位點上進行訓練和測試來預測測試樣本的年齡。因此，交集時鐘方法保證在測試樣本中沒有丟失的時鐘CpG位點。盡管這種方法需要為每個數(shù)據集訓練新的表觀遺傳時鐘，但它最大程度提高了這些數(shù)據集的效用。
DCM：擴張型心肌�。籈S細胞：胚胎干細胞；GW：妊娠周；HNES細胞：人類幼稚胚胎干細胞；iPSCs：誘導多能干細胞；MII卵母細胞：中期II卵母細胞；P：通道；PSCs：多能干細胞；RRBS：減少代表性亞硫酸鹽測序；WGBS：全基因組亞硫酸鹽測序。
圖1：交集時鐘工作流程示意圖。對每個測試樣本進行表觀遺傳年齡預測，工作流程如下：- 確定訓練數(shù)據集和測試樣本之間CpG位點的交集。
- 將訓練集和測試樣本限于交集CpG位點。
- 對訓練集（交集訓練集）和測試樣本（交集測試樣本）進行模型的訓練和測試。
- 對交集訓練集進行五次交集驗證，產生了五個交集時鐘模型（例如ElasticNet模型）。
- 計算五個模型的預測結果平均值，生成樣本的預測（表觀遺傳）年齡。
補充圖S1：按條件、性別和年齡分列的182個訓練樣本（人類血液）的分布情況。為了評估胚胎發(fā)生過程中的表觀遺傳年齡動態(tài)變化，收集可用的人類DNA甲基化（DNAm）數(shù)據集（數(shù)據集2-4），并使用交集時鐘進行分析。交集時鐘對僅限于交集CpG位點訓練集上的交集驗證中表現(xiàn)出高性能（圖2a-c）。數(shù)據集2中的一項研究使用RRBS生成了人類植入前發(fā)育和胚胎干細胞（代表人類外胚層）的全基因組甲基化圖。研究人員處理了包括精子、卵裂、囊胚和人類胚胎干細胞（ES）細胞在內的所有人類樣本的甲基化水平，觀察到卵裂期和囊胚期胚胎的預測表觀遺傳年齡之間沒有顯著變化（p = 0.7378）；囊胚和ES細胞的表觀遺傳年齡顯著下降（p=1.582e-12）（圖2e）。小鼠外胚層（E6.5）與人類ES細胞之間的跨物種比較表明，這些ES細胞是人類外胚層的合理替代物；因此數(shù)據表明，人類植入后外胚層的表觀遺傳年齡也低于植入前階段的表觀遺傳年齡。進一步將交集時鐘應用于另外兩個數(shù)據集（數(shù)據集3和4），其中包含植入前（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚）和植入后（GW 6-11肝臟和絨毛）樣本。觀察到植入前階段之間沒有顯著變化；但植入后樣本的表觀遺傳年齡顯著下降（圖2f，g）�？偟膩碚f數(shù)據表明人類胚胎在早期胚胎發(fā)生期間年輕化。
圖2：交集時鐘揭示人類早期胚胎發(fā)生期間的年輕化事件。(e-g) 不同人類發(fā)育階段樣本的平均預測年齡（表觀遺傳年齡）：圖表顯示交集時鐘對不同人類發(fā)育階段樣本（來自Datasets2–4）的平均預測年齡。在數(shù)據集2中，ES細胞代表植入后外胚層。
(h) 圖表展示交集時鐘對健康對照組和擴張型心肌病患者的纖維細胞及其衍生的誘導多能干細胞（iPSCs）（來自Dataset5）的平均預測年齡。
(j、l、n) 圖表展示交集時鐘對不同數(shù)據集（Datasets6–8）的naïve細胞（重置細胞、HNES1細胞）和primed（常規(guī)PSCs，primed HNES1細胞，代表植入后外胚層）胚胎干細胞（ESC）樣本的平均預測年齡（表觀遺傳年齡）。
為了進一步驗證該方法分析年輕化事件的能力，將交集時鐘應用于人類誘導多能干細胞（iPSCs）數(shù)據集（Dataset 5）。結果表明，成年對照組（p=0.0136）和擴張型心肌病患者（2.679e-05）的成纖維細胞重編程后，表觀遺傳年齡顯著下降（圖2d、h）。
數(shù)據集2-4不僅包含胚胎數(shù)據，還包括精子數(shù)據，在數(shù)據集3中還包括MII卵母細胞樣本。將交集時鐘應用于這些樣本的甲基化譜，發(fā)現(xiàn)精子細胞的表觀遺傳年齡在某些情況下低于植入前階段：在數(shù)據集2和3中的差異顯著（圖2e、f），而在數(shù)據集4中的差異不顯著（圖2g）。此外，人類MII卵母細胞和植入前胚胎之間的表觀遺傳年齡沒有顯著差異（圖2f），盡管精子細胞的表觀遺傳年齡顯著低于MII卵母細胞。目前尚不清楚雄性生殖細胞在配子發(fā)生過程中是否也會經歷年輕化。
無論是來源于囊胚還是通過重編程生成的常規(guī)人類多能干細胞（PSCs），都與小鼠胚胎干細胞不同，代表了多能性的發(fā)育晚期或啟動階段。通過體外重置常規(guī)PSCs或直接從ICM捕獲細胞開發(fā)了多種方法來生成更接近原始表型的PSCs。通過將交集時鐘應用于數(shù)據集6-8，primed（代表早期植入后）和naïve（代表植入前）PSCs的表觀遺傳年齡，并觀察到在所有情況下，primed細胞的表觀遺傳年齡顯著低于naïve細胞（圖2i-n）。
總之，這些數(shù)據支持了年輕化事件發(fā)生在人類早期胚胎發(fā)育期間的假設。
DISCUSSION
本研究結果重現(xiàn)了在小鼠中的發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)胚胎第6.5/7.5天樣本的表觀遺傳年齡與早期胚胎發(fā)生階段相比始終較低。因此，胚胎年輕化事件在小鼠和人類之間保守，并且在兩個物種中都發(fā)生在胚胎發(fā)育的原腸胚形成階段。數(shù)據支持人類胚胎發(fā)生過程中實現(xiàn)對應于生物體最低生物學年齡的“歸零（ground zero）”模型。隨著對“ground zero”認識的不斷發(fā)展，可能會改變對人類生物體生命開始的看法。
在某些情況下，精子細胞的表觀遺傳年齡低于MII卵母細胞和植入前階段胚胎。本研究分析了胚胎年輕化，但目前尚不清楚生殖細胞發(fā)育和配子發(fā)生是否也與年輕化有關，需要進一步研究來闡明這一點。
在唯一可用的潛在訓練數(shù)據集（數(shù)據集1）中，最年長的健康患者是40歲，而年長患者表現(xiàn)出不良的健康表型（SA或MDD，圖S1）。盡管最初研究揭示了健康組與SA組、健康組與MDD組之間的甲基化譜存在顯著差異，但至少部分差異可能是由于健康組與SD/MDD組之間的平均年齡差異所致。同樣可能的是，區(qū)分健康組和SD/MDD組的CpG位點與表觀遺傳時鐘使用的CpG位點不同�？偟膩碚f，在這種情況下，使用所有數(shù)據進行訓練過程是合理的。
先前基于甲基化芯片的人類iPSCs表觀遺傳年齡評估顯示，在重編程過程中表觀遺傳年齡下降（即年輕化）。本研究基于人類亞硫酸鹽測序數(shù)據驗證了這些結果（圖2h），并表明交集時鐘可以檢測到年輕化。
人類胚胎的全基因組CpG甲基化在植入前發(fā)育期間從受精卵到囊胚階段逐漸減少，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中全基因組CpG甲基化增加。相比之下，植入前發(fā)育期間（受精卵、卵裂、桑椹胚和囊胚階段；圖2e-g）表觀遺傳年齡沒有顯著變化，隨后在植入后胚胎（代表性primed PSCs）中表觀遺傳年齡下降（圖2e-g、j、l、n）。這些數(shù)據表明，DNA甲基化維持和de novo甲基化在年輕化事件中發(fā)揮作用，和之前在小鼠中的結果一致。
參考文獻：
Kerepesi C, Gladyshev VN. Intersection clock reveals a rejuvenation event during human embryogenesis. Aging Cell. 2023 Oct;22(10):e13922. doi: 10.1111/acel.13922. PubMed PMID: 37786333.
標簽：
DNA甲基化
