通過(guò)熒光分子成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)頸動(dòng)脈血栓FXIIa三維熒光斷層成像

研究背景

當(dāng)前，臨床對(duì)血栓栓塞性疾病的檢測(cè)通常依賴于間接方法，可能會(huì)造成診斷延遲并延誤及時(shí)治療。

利用分子成像技術(shù)開(kāi)發(fā)出快速、特異性、直接檢測(cè)血栓的靶向分子標(biāo)記物，迫在眉睫。FXIIa（凝血因子X(jué)IIa）是一種用于分子成像的潛在標(biāo)記物，可以激活內(nèi)源性凝血途徑和激肽-激酶系統(tǒng)，引起凝血和炎癥/免疫反應(yīng)。

由于FXII廣泛存在于正常的止血過(guò)程中，其活化形式FXIIa可作為理想的分子靶點(diǎn)，用于血栓的診斷和評(píng)估溶栓治療效果。

2023年6月，《Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology》發(fā)表了澳大利亞貝克心臟和糖尿病研究所Peter Karlheinz研究團(tuán)隊(duì)的最新研究成果。我們通過(guò)對(duì)文章的解讀介紹三維熒光斷層掃描技術(shù)在本研究（心血管疾病診斷探針）中的應(yīng)用。

部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果 
 

3F7與NIR染料成功結(jié)合對(duì)血栓成像

室溫條件下，將3F7或非特異性的BM4（對(duì)照組）與過(guò)量的NIR熒光染料Cy7共孵育2小時(shí)，透析除去多余染料。為了驗(yàn)證Cy7成功結(jié)合，使用SDS-PAGE得到約160 kDa的檢測(cè)帶（圖1A）。凝膠掃描結(jié)果（800 nm），3F7-NIR和BM4-NIR（結(jié)合Cy7“+”）均顯示出熒光信號(hào)，而僅3F7和BM4（未結(jié)合Cy7“-”）未發(fā)出熒光�？贵w3F7與FXIIa具有特異性結(jié)合能力，作者接下來(lái)證明了3F7與近紅外染料的結(jié)合，不會(huì)阻礙其與FXIIa活性位點(diǎn)的結(jié)合。

利用凝血酶體外制備人源血栓，經(jīng)3F7-NIR或BM4-NIR孵育后進(jìn)行成像（圖1C）。與BM4-NIR孵育的血栓（對(duì)照組，1.61±0.33×107）相比，3F7-NIR組血栓熒光強(qiáng)度顯著增加（4.85±0.22×107，P=0.029），如圖1D。初步表明與熒光標(biāo)記結(jié)合的3F7（3F7-NIR）對(duì)血栓診斷成像方法。

圖1. 熒光成像說(shuō)明3F7和BM4與近紅外(NIR)染料成功結(jié)合，并成功靶向 FXIIa（凝血因子X(jué)IIa）對(duì)急性血栓進(jìn)行成像。

靶向FXIIa對(duì)頸動(dòng)脈血栓體內(nèi)三維熒光斷層成像

為了研究3F7-NIR靶向結(jié)合FXIIa對(duì)體內(nèi)急性血栓的3D-FLECT成像潛力，作者利用FeCl3誘導(dǎo)頸動(dòng)脈血栓模型。此前已被證明，當(dāng)3F7劑量高于5 µg/g BW時(shí)，可以防止小鼠血管栓塞。因此，作者選擇了較低劑量的3F7-NIR（2.5 µg/g BW），以確保3F7-NIR產(chǎn)生良好的成像信號(hào)時(shí)，最佳診斷血栓作用所需的低劑量。

在小鼠右頸動(dòng)脈中誘發(fā)血栓，以左頸動(dòng)脈作為健康對(duì)照。3F7-NIR及BM4-NIR在注射5分鐘后進(jìn)行3D-FLECT成像。對(duì)采集到的熒光信號(hào)與CT成像數(shù)據(jù)融合進(jìn)行3D重建。注射3F7-NIR（圖2A）的小鼠中，誘導(dǎo)血栓部位產(chǎn)生強(qiáng)熒光信號(hào)，BM4-NIR組的健康或損傷頸動(dòng)脈中未觀察到熒光信號(hào)。

研究人員為了確認(rèn)體內(nèi)成像結(jié)果，將切除頸動(dòng)脈進(jìn)行離體成像（圖2B）。損傷頸動(dòng)脈出現(xiàn)3F7-NIR的強(qiáng)熒光信號(hào)，但未受傷的健康血管無(wú)熒光，證明了3F7對(duì)血栓的選擇特異性靶向。

此外，與BM4-NIR組相比，3F7-NIR組的信號(hào)強(qiáng)度顯著增加（4.37±1.48 VS 1.21±0.77；P=0.002；圖2C)，對(duì)頸動(dòng)脈切片熒光掃描與HE染色，確認(rèn)3F7-NIR的熒光信號(hào)定位于血栓部位（圖2D）。

圖2.靶向血栓中FXIIa三維(3D)熒光發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(FLECT)成像。

A.三維FLECT圖像展示近紅外（NIR）染料標(biāo)記的3F7成功靶向結(jié)合體內(nèi)的血栓。熒光和CT的雙模態(tài)成像在受傷的頸動(dòng)脈上檢測(cè)到熒光信號(hào)。而小鼠注射的非結(jié)合BM4-NIR對(duì)照抗體時(shí)，未觀察到熒光信號(hào)；
B.IVIS圖像展示3F7-NIR特異性靶向損傷頸動(dòng)脈，對(duì)健康血管沒(méi)有信號(hào)強(qiáng)度的變化；且都未觀察到對(duì)照組BM4-NIR相關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度變化；
C.熒光強(qiáng)度定量分析，與對(duì)照組BM4-NIR（藍(lán)色）相比，3F7-NIR（紅色）注射后在損傷動(dòng)脈的熒光強(qiáng)度顯著增加（平均輻射RE）；信號(hào)強(qiáng)度以其相應(yīng)的健康血管作為對(duì)照歸一化；
D.損傷頸動(dòng)脈切片的HE染色圖像以及近紅外熒光成像展示了3F7-NIR特異性結(jié)合在血管腔內(nèi)的血栓，而BM4-NIR未觀察到熒光。

（FLECT CT-Ex/Em：730 nm / 803/60 nm）

技術(shù)要點(diǎn)介紹：可定量化的全角度三維小動(dòng)物活體成像技術(shù)應(yīng)用

FLECT/CT在文章中被應(yīng)用于急性血栓形成的分子成像，通過(guò)結(jié)合熒光成像和計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT），利用熒光標(biāo)記的分子探針對(duì)血栓的特異性靶向結(jié)合，實(shí)現(xiàn)血栓精確定位的三維成像。該技術(shù)使用激光光源，不需要解剖，能夠檢測(cè)深層組織熒光信號(hào)，具有直觀、準(zhǔn)確、高靈敏度成像的特點(diǎn)，為臨床前研究提供了可靠的依據(jù)。研究人員還可以利用FLECT/CT實(shí)現(xiàn)對(duì)血栓絕對(duì)定量分析，為心血管相關(guān)疾病的研究和治療提供重要的工具和方法。

原文信息：Activated Coagulation FXII: A Unique Target for In Vivo Molecular Imaging
作者：Xiaowei Wang*，Karlheinz Peter*
單位：Baker IDI Heart and Diabetes Institute，Melbourne
期刊：Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology
原文鏈接：https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.122.318883

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