利用靶向預(yù)活化巨噬細(xì)胞膜包被納米粒子實(shí)現(xiàn)結(jié)核病光熱治療

本文要點(diǎn)：用于治療結(jié)核病(TB)的傳統(tǒng)抗生素存在耐藥性和多種并發(fā)癥等缺點(diǎn)。作者將分枝桿菌刺激的巨噬細(xì)胞膜包被納米粒子上，用于治療結(jié)核病。包被的納米顆粒攜帶結(jié)核分枝桿菌的特異性受體，這使它們能夠同時(shí)靶向結(jié)核性肉芽腫和內(nèi)部結(jié)核分枝桿菌。通過1064 nm激光照射，這些納米粒子產(chǎn)生的光熱效應(yīng)根除了結(jié)核分枝桿菌，減輕了肺部的病理損傷和過度炎癥，相比一線抗生素的聯(lián)合治療效果更好。這種精確的光熱模式在NIR-IIb使用雙靶向成像，為結(jié)核病治療提供了新的策略。

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圖1. 基于預(yù)激活巨噬細(xì)胞膜包被光熱納米粒子的結(jié)核病精確治療診斷策略

 

作者合成了TPE-BT-BBTD，是一種目前已報(bào)道的所有AIE發(fā)光體中具有最長的吸收峰（接近1000 nm）的光熱分子。通過納米沉淀法將TPE-BT-BBTD分子封裝在聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)核中，將M.marinum預(yù)刺激的巨噬細(xì)胞細(xì)胞膜包被到PLGA核上，形成BBTD@PM NPs。

靜脈注射BBTD@PM NPs，能迅速聚集在肺部肉芽腫中并成功地在原地點(diǎn)亮了單個(gè)肉芽腫。在激光照射下，激活BBTD@PM NPs的光熱行為能夠靶向殺死結(jié)合分枝桿菌，并減輕肺組織的病理損傷和炎癥水平。該策略優(yōu)于聯(lián)合使用四種一線抗生素，并可指導(dǎo)臨床環(huán)境中對(duì)藥物敏感和耐藥結(jié)核病的管理。

 

為了獲得M. marinum刺激的巨噬細(xì)胞，將M. marinum與RAW 264.7細(xì)胞共培養(yǎng)不同時(shí)間，巨噬細(xì)胞發(fā)生了明顯的形態(tài)變化(圖2a)。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)M. marinum刺激的巨噬細(xì)胞富集與TB, PRRs和炎癥相關(guān)(圖2b)。進(jìn)一步的分析顯示，M. marinum刺激主要促進(jìn)了PRRs的激活，尤其是TLRs，以及免疫和炎癥反應(yīng)(圖2d)。作者還檢測了巨噬細(xì)胞膜表面的TLRs，發(fā)現(xiàn)M. marinum刺激下TLR2、TLR4和TLR6基因的表達(dá)顯著增加(圖2j-m)。

圖3. TPE-BT-BBTD和BBTD@PM NPs表征

 

TPE-BT-BBTD在THF溶劑中的極長吸收光譜(圖3b)，可以在980和1064 nm的激光激發(fā)下產(chǎn)生熒光發(fā)射，在1064 nm的輻照下，TPE-BT-BBTD顯示出熒光發(fā)射，最大光致發(fā)光(PL)強(qiáng)度在1305 nm左右(圖3c)。隨著水分?jǐn)?shù)變化，TPE-BT-BBTD的PL強(qiáng)度相應(yīng)增大，驗(yàn)證了其AIE性能(圖3d)。TEM圖像顯示BBTD@PM NPs具有典型的球形核殼結(jié)構(gòu)，且巨噬細(xì)胞膜成功地覆蓋在PLGA核表面(圖3f)。在生理鹽水和FBS中，BBTD@PM NPs的大小幾乎保持不變(圖3g)，表明細(xì)胞膜的涂層有效地增強(qiáng)了NPs的尺寸穩(wěn)定性。紫外-可見吸收光譜顯示，由于封裝了TPE-BT-BBTD，三種水溶液的吸收時(shí)間都很長，最大吸收峰紅移至993 nm(圖3h)。在1064 nm激光照射下，BBTD@PM NPs發(fā)出強(qiáng)烈的NIR-II熒光，在1323 nm和1542 nm處有兩個(gè)發(fā)射峰(圖3i)。此外，研究還評(píng)估了BBTD@PM NPs和對(duì)照NPs的光熱性能。與PBS相比，在1064 nm激光照射下，所有三種類型的NPs都表現(xiàn)出強(qiáng)大的光熱轉(zhuǎn)換行為。

圖4. BBTD@PM NPs對(duì)結(jié)核分枝桿菌的體外靶向和抗菌活性

 

首先，通過體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BBTD@PM NPs能夠特異性地結(jié)合結(jié)核分枝桿菌，而對(duì)其他細(xì)菌沒有結(jié)合能力(圖4d)。然后，通過活/死細(xì)菌活力測定，證實(shí)了BBTD@PM NPs在1064 nm激光照射下對(duì)結(jié)核分枝桿菌具有光熱殺菌作用(圖4e)。研究發(fā)現(xiàn)，BBTD@PM NPs與1064 nm激光聯(lián)合使用能大規(guī)模破壞結(jié)核分枝桿菌，導(dǎo)致細(xì)菌廣泛解體和破裂(圖4f-h)。這一結(jié)果表明，該靶向光熱殺菌策略導(dǎo)致耐藥的可能性極低。

圖5. 結(jié)核性肉芽腫和體內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的靶向NIR-IIb成像

 

對(duì)BBTD@PM NPs的體內(nèi)NIR-IIb成像潛力進(jìn)行評(píng)估。研究發(fā)現(xiàn)，BBTD@PM NPs在1064 nm照射下呈現(xiàn)出濃度依賴性的熒光發(fā)射(圖5a)，并具有良好的組織穿透能力，最大組織穿透深度為9 mm(圖5b)。在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)中，BBTD@PM NPs能夠快速到達(dá)感染部位，選擇性地積聚在肉芽腫中(圖5f)，并具有精確的靶向和長期跟蹤能力。與對(duì)照NPs相比，BBTD@PM NPs能夠清晰地識(shí)別直徑約0.2 mm的非常小的肉芽腫(圖5i,j)。這種成像策略提供了比常規(guī)NIR-I成像高得多的分辨率，能夠清晰識(shí)別肺組織中的肉芽腫。此外，DiO標(biāo)記的BBTD@PM NPs成功進(jìn)入肉芽腫的中心壞死部位，并與其中的mCherry標(biāo)記的H37Ra桿菌結(jié)合(圖5k,l)，表明其具有雙重靶向能力。

 

為了全面評(píng)估了BBTD@PM NPs在體內(nèi)的治療效果，在H37Ra感染第21天肺部形成特征性肉芽腫后，對(duì)TB小鼠靜脈注射PBS、BBTD@RBC NPs、BBTD@M NPs、BBTD@PM NPs或四種一線抗生素聯(lián)合使用。經(jīng)過1064 nm照射后，BBTD@PM NPs的殺菌能力顯著高于其他處理，甚至大大高于一線抗生素的聯(lián)合殺菌能力(圖6a,b)。研究發(fā)現(xiàn)，BBTD@PM  NPs和1064 nm輻照治療顯著減輕了肺部彌漫性炎癥和組織壞死(圖6c)。肺組織TNF-α(圖6d)和IFN-γ(圖6e)免疫組化染色顯示，BBTD@PM NPs和1064 nm輻照組的抗炎作用最強(qiáng)，甚至高于抗生素聯(lián)合治療組。

作者介紹了可在 1,064 nm 處興奮的預(yù)活化巨噬細(xì)胞樣 BNP，具有病原體和病原體的雙重靶向能力、極長的波長吸收、NIR-IIb熒光發(fā)射勢和顯著的光熱性能。這些NPs可以實(shí)現(xiàn)肺部肉芽腫原位的高分辨率NIR-IIb成像，對(duì)結(jié)核分枝桿菌發(fā)揮光熱殺傷作用，具有肺組織修復(fù)的功效，并具有抗炎活性。這種雙重靶向和NIR-IIb成像引導(dǎo)的精確光熱模式有望為制定臨床環(huán)境中的結(jié)核病管理可行策略帶來新見解。

 

參考文獻(xiàn)

Li B, Wang W, Zhao L, Wu Y, Li X, Yan D, Gao Q, Yan Y, Zhang J, Feng Y, Zheng J, Shu B, Wang J, Wang H, He L, Zhang Y, Pan M, Wang D, Tang BZ, Liao Y. Photothermal therapy of tuberculosis using targeting pre-activated macrophage membrane-coated nanoparticles. Nat Nanotechnol. 2024 Feb 21.

 

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