ENCODE和modENCODE聯(lián)盟的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南和注意事項(xiàng)

ChIP-seq（染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序）實(shí)驗(yàn)指南和實(shí)踐（ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia），由ENCODE（Encyclopedia of DNA Elements）和modENCODE（Model Organism ENCODE）聯(lián)盟研究人員撰寫(xiě)。文章發(fā)表在《Genome Research》期刊上，從ChIP概述、ChIP-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)、數(shù)據(jù)評(píng)估及數(shù)據(jù)報(bào)告指南四個(gè)方面對(duì)ChIP-seq進(jìn)行了相關(guān)介紹，旨在提供一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化框架，以確保ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量和數(shù)據(jù)的可靠性。小編分享其中的ChIP-seq概述、ChIP-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)。

ChIP概述：
全基因組ChIP實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是定位整個(gè)基因組中具有最大信噪比和完整性目標(biāo)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。ChIP-seq的基本流程如圖1A所示。用化學(xué)試劑處理細(xì)胞或組織，使蛋白質(zhì)與DNA共價(jià)交聯(lián)。然后是通過(guò)細(xì)胞破碎和超聲處理，或是酶解（某些情況），將染色質(zhì)剪至100-300bp大小。再通過(guò)靶向該因子的特異性抗體純化目標(biāo)蛋白（轉(zhuǎn)錄因子、組蛋白修飾、RNA聚合酶等）及其結(jié)合DNA，相對(duì)于起始染色質(zhì)進(jìn)行富集。另外，也可以生成表達(dá)表位標(biāo)記因子的細(xì)胞系，并通過(guò)表位標(biāo)簽免疫沉淀融合蛋白。
免疫富集后，交聯(lián)被逆轉(zhuǎn)，富集的DNA被純化并制備用于分析。在ChIP-chip中，DNA與差異標(biāo)記的參考DNA一起被熒光標(biāo)記并與DNA微陣列雜交。在ChIP-seq中，通過(guò)高通量DNA測(cè)序分析，在所有設(shè)計(jì)中，實(shí)驗(yàn)樣品中的ChIP信號(hào)將與從適當(dāng)?shù)膶?duì)照染色質(zhì)或?qū)φ彰庖叱恋碇苽涞念愃铺幚淼膮⒖紭悠愤M(jìn)行比較來(lái)確定假定富集的基因組區(qū)域。

不同的蛋白質(zhì)類別與基因組具有不同的互作模式，需要不同的分析方法：
1. 點(diǎn)源因子（Point-source factors）和某些染色質(zhì)修飾定位于特定位置，產(chǎn)生高定位的ChIP-seq信號(hào)。這一類包括大多數(shù)序列特異性轉(zhuǎn)錄因子、它們的輔助因子、以及在一些情況下與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)或增強(qiáng)子相關(guān)的組蛋白標(biāo)記。這些構(gòu)成了ENCODE和modENCODE項(xiàng)目的大部分內(nèi)容。
2. 廣源因子（Broad-source factors）與大的基因組區(qū)域相關(guān)。例如，某些染色標(biāo)記（H3K9me3、H3K36me3等）以及與轉(zhuǎn)錄延伸或抑制相關(guān)的染色質(zhì)蛋白（例如ZNF217）。
3. 混合源因子（Mixed-source factors）可以在基因組某些位點(diǎn)以點(diǎn)源方式結(jié)合，但在其他位置形成更廣泛結(jié)合域，如RNA聚合酶II以及一些染色質(zhì)修飾蛋白（SUZ12）以這種方式表現(xiàn)。
  A. 特定ENCODE指南的步驟用紅色表示。其他步驟存在標(biāo)準(zhǔn)ENCODE協(xié)議，應(yīng)針對(duì)每種新的細(xì)胞系/組織類型或超聲進(jìn)行驗(yàn)證和優(yōu)化。（*）常用但可選的步驟。
B. 表征新抗體或抗體批次的流程圖。
C. 使用抗體表征檢測(cè)的流程圖。
 
ChIP 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南
（1）測(cè)序和文庫(kù)復(fù)雜性
對(duì)于每個(gè)哺乳動(dòng)物基因組的ChIP-seq點(diǎn)源庫(kù)，ENCODE的目標(biāo)是在每次重復(fù)中獲得≥10M唯一比對(duì)reads，以及目標(biāo)NRF（非冗余分?jǐn)?shù)）≥0.8。modENCODE點(diǎn)源因子的相應(yīng)目標(biāo)是每次重復(fù)獲得≥2M唯一比對(duì)reads，≥0.8 NRF。果蠅中的廣源ChIP-seq，modENCODE目標(biāo)reads是≥5M，哺乳動(dòng)物廣源組蛋白標(biāo)記的ENCODE臨時(shí)目標(biāo)在NRF≥0.8時(shí)的唯一比對(duì)reads≥20M。
（2）對(duì)照文庫(kù)
ENCODE為每種細(xì)胞類型、組織或胚胎集合生成并測(cè)序一個(gè)對(duì)照ChIP庫(kù)，并將文庫(kù)測(cè)序至合適深度（至少等于且優(yōu)選大于測(cè)序最深的實(shí)驗(yàn)文庫(kù)）。如果成本限制允許，應(yīng)該從每個(gè)染色質(zhì)制備和超聲處理批次中制備對(duì)照文庫(kù)。重要的是，如果培養(yǎng)條件、處理、染色質(zhì)剪切方案或儀器有明顯差異，則需要進(jìn)行新的對(duì)照實(shí)驗(yàn)。
（3）可重復(fù)性
實(shí)驗(yàn)至少設(shè)置兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)以確�？芍貜�(fù)性。為了使ENCODE數(shù)據(jù)通過(guò)提交標(biāo)準(zhǔn)，使用IDR方法通過(guò)分析確定一致性，如果未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，則需要進(jìn)行第三次重復(fù)。通過(guò)IDR確定用于后續(xù)分析的高度可重復(fù)peak的截止值（通常使用1%的閾值）。
本ChIP實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)指南確保了ChIP-seq實(shí)驗(yàn)?zāi)軌虍a(chǎn)生高質(zhì)量、可重復(fù)的數(shù)據(jù)，這對(duì)于后續(xù)的分析和生物學(xué)發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。通過(guò)遵循這些標(biāo)準(zhǔn)，研究人員可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，從而為科學(xué)界提供有價(jià)值的數(shù)據(jù)資源。
 
ChIP-seq實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：
（1）抗體和免疫共沉淀特異性：
ChIP實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量取決于抗體的特異性和親和沉淀步驟中實(shí)現(xiàn)的富集程度。人類細(xì)胞和果蠅胚胎中的大多數(shù)ENCODE/modENCODE ChIP實(shí)驗(yàn)用抗個(gè)體因子和組蛋白修飾抗體進(jìn)行。

抗體缺陷主要有兩種類型：（1）對(duì)預(yù)期靶點(diǎn)的反應(yīng)性差，和/或（2）與其他DNA相關(guān)蛋白的交叉反應(yīng)性。為此制定了一套工作標(biāo)準(zhǔn)和報(bào)告指南，旨在提供試劑識(shí)別目標(biāo)抗原的置信度，并且與其他染色體蛋白的交叉反應(yīng)最小。用于測(cè)量抗體特異性和敏感性的廣泛可用的方法范圍從半定量到定性，每種方法都可能存在噪聲和解釋問(wèn)題。因此強(qiáng)調(diào)報(bào)告抗體表征數(shù)據(jù)，以便對(duì)ChIP數(shù)據(jù)或試劑本身做出明智的判斷。當(dāng)然也可能使用不嚴(yán)格遵守這些指南的試劑進(jìn)行成功實(shí)驗(yàn)。例如，在免疫印跡分析中檢測(cè)到的交叉反應(yīng)蛋白可能不會(huì)干擾ChIP，因?yàn)樵摰鞍撞桓街�于染色質(zhì)。不同類型的二次測(cè)試可以幫助提供關(guān)于初始評(píng)估失敗的抗體可接受性的信心。

兩個(gè)測(cè)試（初次測(cè)試和二次測(cè)試）用于表征每個(gè)單克隆抗體或不同批次的相同多克隆抗體。初次和二次測(cè)試的順序受執(zhí)行每個(gè)測(cè)試所需工作量的影響，初次試驗(yàn)更容易對(duì)大量抗體進(jìn)行。轉(zhuǎn)錄因子抗體與組蛋白修飾抗體的測(cè)試有所不同。典型的工作流程見(jiàn)圖2B和圖2C。通過(guò)和未通過(guò)這些測(cè)試的抗體示例如圖2A所示。

聯(lián)盟還包括五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)之一作為二次測(cè)試表征：（1）通過(guò)突變或RNAi“敲低”因子，（2）使用靶向蛋白質(zhì)上多個(gè)表位或靶向同一復(fù)合物不同成員抗體的獨(dú)立ChIP實(shí)驗(yàn)，（3）使用帶有表位標(biāo)記的構(gòu)建體進(jìn)行免疫沉淀，（4）親和富集，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，或（5）結(jié)合位點(diǎn)基序（motif）分析。motif富集是最容易進(jìn)行的檢測(cè)，但需要有關(guān)蛋白質(zhì)結(jié)合序列的預(yù)先存在的信息，并假設(shè)motif在給定的細(xì)胞來(lái)源中被感興趣的因子唯一識(shí)別。具有第二抗體或靶向表位標(biāo)記的構(gòu)建體的ChIP和與ChIP結(jié)合的siRNA實(shí)驗(yàn)提供了獨(dú)立的證據(jù)，表明靶位點(diǎn)受目標(biāo)因子結(jié)合。質(zhì)譜法對(duì)于在免疫印跡上觀察到多個(gè)或意外條帶并且懷疑存在剪接同種型，翻譯后修飾或降解的情況特別有用。此外，它可以精確識(shí)別潛在的ChIP信號(hào)替代源，通常具有新穎的生物學(xué)意義，可以通過(guò)額外的ChIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試。由于進(jìn)行這些檢測(cè)需要大量精力和費(fèi)用，聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)僅要求進(jìn)行一次二次測(cè)試。約20%（227個(gè)中的44個(gè)）的測(cè)試市售抗轉(zhuǎn)錄因子抗體符合這些表征指南，并且在ChIP-seq分析中也起作用。

迄今為止，55%的聯(lián)盟抗體已提交質(zhì)譜數(shù)據(jù)，28%使用第二抗體、表位標(biāo)簽或已知復(fù)合物的替代成員的ChIP數(shù)據(jù)，10%使用來(lái)自motif分析的數(shù)據(jù)，7%使用siRNA敲低數(shù)據(jù)。

驗(yàn)證組蛋白修飾抗體涉及多個(gè)問(wèn)題：（1）對(duì)其他細(xì)胞核/染色質(zhì)蛋白的特異性，（2）對(duì)未修飾的組蛋白和非靶修飾的組蛋白殘基（例如H3K9me與H3K27me）的特異性，（3）對(duì)同一殘基（例如H3K9me1，H3K9me2和H3K9me3）的單甲基化，二甲基化和三甲基化的特異性，以及（4）批次間變異。對(duì)于所有聯(lián)盟組蛋白檢測(cè)，設(shè)定了應(yīng)用免疫印跡分析和以下二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)之一的標(biāo)準(zhǔn)：肽結(jié)合試驗(yàn)(dot blots)、質(zhì)譜分析、含有相關(guān)組蛋白修飾酶或突變體組蛋白敲低細(xì)胞系中的免疫反應(yīng)性分析或基因組注釋富集。
   
（2）使用表位標(biāo)記結(jié)構(gòu)物的免疫共沉淀：
鑒于在獲得適合ChIP抗體方面存在挑戰(zhàn)，一個(gè)有吸引力的替代方法是用外源性表位標(biāo)記該因子，并用對(duì)該標(biāo)記特異性表征良好的單克隆試劑進(jìn)行免疫沉淀。表位標(biāo)記通過(guò)使用可用于許多不同因子的高度特異性試劑來(lái)解決抗體變異和與多基因家族不同成員的交叉反應(yīng)問(wèn)題。然而，這引入了對(duì)表達(dá)水平以及標(biāo)記是否會(huì)改變因子活性的擔(dān)憂。

（3）重復(fù)、測(cè)序深度、文庫(kù)復(fù)雜性和位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)：
來(lái)自獨(dú)立細(xì)胞培養(yǎng)物、胚胎庫(kù)或組織樣本的生物重復(fù)實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估可重復(fù)性。初始 RNA 聚合酶 II ChIP-seq 實(shí)驗(yàn)表明，兩個(gè)以上的重復(fù)沒(méi)有顯著改善位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)。因此ENCODE聯(lián)盟設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)，即所有ChIP檢測(cè)都將在兩個(gè)獨(dú)立的生物重復(fù)上進(jìn)行。不可重復(fù)發(fā)現(xiàn)率（IDR）分析方法現(xiàn)在被用于評(píng)估重復(fù)一致性和設(shè)置閾值。

對(duì)于典型的點(diǎn)源DNA結(jié)合因子，ChIP-seq鑒定出的陽(yáng)性位點(diǎn)數(shù)量通常會(huì)隨著測(cè)序reads數(shù)量而增加。因?yàn)镃hIP信號(hào)強(qiáng)度的連續(xù)統(tǒng)一體，而不是一組界限分明且離散的陽(yáng)性位點(diǎn)。由于更多reads提供了更高的統(tǒng)計(jì)能力，因此可以在更大的數(shù)據(jù)集中更有信心地檢測(cè)到較弱的位點(diǎn)。圖3顯示了對(duì)11個(gè)人類ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集的peak calling分析，這些數(shù)據(jù)集獲得了深度序列數(shù)據(jù)（3000~1億比對(duì)讀長(zhǎng)）。對(duì)于結(jié)合位點(diǎn)很少的因子，觀察到reads數(shù)明顯飽和，但對(duì)于所有其他因子，reads數(shù)繼續(xù)以不同的速率增加，包括使用100M比對(duì)reads calling>150000 peaks的情況。對(duì)peaks信號(hào)分析表明，該信號(hào)在較大的測(cè)序深度下始終保持平穩(wěn)。目前將20M比對(duì)reads作為點(diǎn)源轉(zhuǎn)錄因子的所有ENCODE ChIP實(shí)驗(yàn)的最低值，通常中位數(shù)富集5~13倍；在20M reads鑒定出的新peaks富集程度約為最強(qiáng)peaks富集程度的20%（圖3C）。且通過(guò)測(cè)序到更深深度可以發(fā)現(xiàn)許多新peaks，其富集值為3~7倍。這些區(qū)域中的許多可能對(duì)應(yīng)于低親和力位點(diǎn)和/或開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域，這些區(qū)域與TF的特異性結(jié)合較少。
  （A） 11個(gè)ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集，使用Peak-seq（0.01%FDR截止值）calling的peaks數(shù)。
（B） peaks calling和唯一比對(duì)reads數(shù)之間的關(guān)系，為11個(gè)ChIP-seq數(shù)據(jù)集calling peaks數(shù)。插圖為HepG2細(xì)胞的MAFK數(shù)據(jù)集的peaks數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集是目前測(cè)序最深的ENCODE ChIP-seq數(shù)據(jù)集（由于相對(duì)于其他數(shù)據(jù)集的reads明顯較大，因此單獨(dú)顯示）。數(shù)據(jù)集由細(xì)胞系和轉(zhuǎn)錄因子（例如細(xì)胞系HepG2，轉(zhuǎn)錄因子MAFK）表示。
（C） 隨著測(cè)序深度的增加，新calling peaks值的富集倍數(shù)變化。每增加2.5M唯一比對(duì)reads，計(jì)算新calling peaks與IgG對(duì)照數(shù)據(jù)集（在相同測(cè)序深度下測(cè)序）相比的中位數(shù)富集倍數(shù)，并將其繪制成圖表。

ChIP信號(hào)強(qiáng)度與生物調(diào)節(jié)活性的關(guān)系是當(dāng)前積極研究的領(lǐng)域。已知增強(qiáng)子的生物活性在文獻(xiàn)中被定義，并且與ChIP-seq信號(hào)強(qiáng)度相比，其分布相當(dāng)廣泛。一些高活性轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子可重復(fù)地顯示適度的ChIP信號(hào)（圖4B）。這意味著不能先驗(yàn)地為ChIP peaks數(shù)或ChIP信號(hào)強(qiáng)度設(shè)置特定的目標(biāo)閾值，以確保包含所有功能位點(diǎn)。因此，一個(gè)實(shí)際的目標(biāo)是通過(guò)在合理的經(jīng)費(fèi)限制內(nèi)，通過(guò)優(yōu)化免疫沉淀和深度測(cè)序來(lái)最大限度地發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的點(diǎn)源因子，ENCODE對(duì)每個(gè)生物學(xué)重復(fù)至少產(chǎn)生10M唯一比對(duì)reads（每個(gè)因子至少提供20M唯一比對(duì)reads）；蠕蟲(chóng)和蒼蠅的每個(gè)重復(fù)至少產(chǎn)生2M唯一比對(duì)reads。對(duì)于廣泛的富集區(qū)域，目前正在研究適當(dāng)數(shù)量的唯一比對(duì)reads，但目前哺乳動(dòng)物細(xì)胞的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)重復(fù)至少產(chǎn)生20M唯一比對(duì)reads，蠕蟲(chóng)和蒼蠅每個(gè)重復(fù)至少產(chǎn)生5M唯一比對(duì)reads。
    （A） 文庫(kù)的復(fù)雜性。表示比對(duì)到正（紅色）或負(fù)鏈（藍(lán)色）的單個(gè)read。
（B） 功能性調(diào)控元件與ChIP-seq信號(hào)強(qiáng)度的分布。在分化的小鼠肌細(xì)胞中，針對(duì)肌細(xì)胞生成素（肌肉分化的主要調(diào)節(jié)劑）進(jìn)行ChIP-seq。雖然許多廣泛表征的肌肉調(diào)節(jié)元件表現(xiàn)出強(qiáng)烈的肌生成素結(jié)合，但大量已知的功能位點(diǎn)處于結(jié)合強(qiáng)度連續(xù)體的低端。
（C） calling的peaks數(shù)量與ChIP富集的關(guān)系。除了特殊情況外，成功的實(shí)驗(yàn)可以為大多數(shù)TF鑒定出數(shù)千到數(shù)萬(wàn)個(gè)peaks，數(shù)百或低數(shù)千的數(shù)字表示失敗。使用具有默認(rèn)閾值的MACS calling peaks。
（D） 生成交叉相關(guān)圖。通過(guò)將reads按照比對(duì)到的鏈方向移動(dòng)增減堿基對(duì)，并計(jì)算了每條鏈的每個(gè)位置reads數(shù)向量之間的Pearson相關(guān)性。reads覆蓋以wigglegram圖表示。
（E） 在ChIP實(shí)驗(yàn)中通常觀察到兩個(gè)交叉相關(guān)peaks，一個(gè)對(duì)應(yīng)于讀長(zhǎng)（“phantom”peaks），另一個(gè)對(duì)應(yīng)于文庫(kù)的平均片段長(zhǎng)度。
（F） 對(duì)于1052個(gè)人ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，calling區(qū)域內(nèi)的reads數(shù)與相對(duì)交叉相關(guān)系數(shù)之間的相關(guān)性。
（G） 兩個(gè)peaks的絕對(duì)高度和相對(duì)高度是ChIP-seq實(shí)驗(yàn)成功的有用決定因素。高質(zhì)量IP的特征是ChIP peaks遠(yuǎn)高于“phantom”peaks，而在失敗的實(shí)驗(yàn)中通常很小或沒(méi)有這樣的峰。這個(gè)指標(biāo)有助于判斷實(shí)驗(yàn)中抗體對(duì)目標(biāo)蛋白的富集效果。
 
位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)和可重復(fù)性也受到ChIP-seq測(cè)序文庫(kù)復(fù)雜性的影響（圖4A）。將文庫(kù)復(fù)雜性定義為非冗余DNA片段的比例。隨著文庫(kù)測(cè)序深度的增加，最終達(dá)到了一個(gè)點(diǎn)，復(fù)雜性將耗盡，相同的PCR擴(kuò)增DNA片段將被重復(fù)測(cè)序。當(dāng)在IP期間分離出非常少量的DNA或由于文庫(kù)構(gòu)建問(wèn)題時(shí)，文庫(kù)復(fù)雜性可能會(huì)降低。

一個(gè)有用的復(fù)雜性度量是數(shù)據(jù)集中非冗余比對(duì) reads比例（非冗余比例或NRF），將其定義為基因組中唯一可比對(duì)reads比對(duì)到的位點(diǎn)與唯一可比對(duì)reads總數(shù)之間的比率，類似于冗余度量。NRF隨著測(cè)序深度的增加而降低，對(duì)于點(diǎn)源TF，目標(biāo)在10M唯一比對(duì)reads的NRF≥0.8。隨著測(cè)序技術(shù)改進(jìn)和每條泳道的reads達(dá)到100M將成為可能，即使來(lái)自點(diǎn)源因子庫(kù)的復(fù)雜文庫(kù)也可能在比必要的深度更大的深度進(jìn)行測(cè)序。為了最大化每次DNA測(cè)序運(yùn)行可以獲得的信息并防止過(guò)度測(cè)序，可以使用條形碼和合并策略。

（4）對(duì)照樣品（Control sample）：
適當(dāng)?shù)膶?duì)照數(shù)據(jù)集對(duì)于d任何ChIP-seq實(shí)驗(yàn)的分析都至關(guān)重要，因?yàn)槌�聲處理過(guò)程中的DNA斷裂不均勻。例如開(kāi)放染色質(zhì)的某些區(qū)域優(yōu)先在超聲處理的樣品中表示，還有一些平臺(tái)特定的測(cè)序效率偏差會(huì)導(dǎo)致不均勻性。有兩種產(chǎn)生對(duì)照DNA樣本的基本方法減輕了這些問(wèn)題對(duì)結(jié)合位點(diǎn)鑒定的影響：（1）從與免疫沉淀DNA相同條件下交聯(lián)和片段化的細(xì)胞中分離DNA (“Input” DNA)；（2）使用與不相關(guān)的非核抗原（“IgG”對(duì)照）反應(yīng)的對(duì)照抗體進(jìn)行“模擬”ChIP反應(yīng)。對(duì)于這兩種類型的對(duì)照，編碼組序列的深度至少等于且優(yōu)選大于ChIP樣本的深度。雖然IgG對(duì)照比“Input”對(duì)照更接近于模擬ChIP實(shí)驗(yàn)，但重要的是，IgG對(duì)照免疫沉淀可恢復(fù)足夠的DNA，以建立一個(gè)與實(shí)驗(yàn)樣品具有足夠高復(fù)雜性的文庫(kù)；否則，使用該對(duì)照進(jìn)行的結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別可能會(huì)有很大偏差。

無(wú)論使用何種類型的對(duì)照，ENCODE和modENCODE組都會(huì)對(duì)每個(gè)細(xì)胞系，發(fā)育階段和不同的培養(yǎng)條件/處理進(jìn)行單獨(dú)的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，因?yàn)橛绊懭旧�質(zhì)制備的倍性、基因型和表觀遺傳特征存在已知和未知的差異。為了作為有效的對(duì)照，使用相同的協(xié)議來(lái)構(gòu)建ChIP和對(duì)照測(cè)序文庫(kù)（即與PCR擴(kuò)增次數(shù)、片段大小等相同）。已經(jīng)觀察到具有特別強(qiáng)的超聲波偏差的對(duì)照文庫(kù)，它們可能會(huì)對(duì)peaks calling產(chǎn)生不利影響。ENCODE/modENCODE組還盡可能為每批超聲處理的樣品生成單獨(dú)的對(duì)照，以控制可能的超聲處理變化。

（5）Peak calling：
將reads比對(duì)到基因組后，使用peaks calling軟件來(lái)鑒定ChIP富集區(qū)域。SPP、PeakSeq和MACs這些算法的結(jié)果output通常按絕對(duì)信號(hào)（reads數(shù)）或通過(guò)計(jì)算的富集顯著性（P值和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率）對(duì)區(qū)域進(jìn)行排序。因?yàn)镃hIP信號(hào)強(qiáng)度是一個(gè)連續(xù)體，弱位點(diǎn)多于強(qiáng)位點(diǎn)（圖4B），最終peaks列表的組成在很大程度上取決于特定的參數(shù)設(shè)置和使用的算法以及實(shí)驗(yàn)本身的質(zhì)量。閾值太寬松會(huì)導(dǎo)致每次重復(fù)假陽(yáng)性比例很高，但后續(xù)分析可以從最終聯(lián)合peaks確定中去除假陽(yáng)性。不同的peak calling算法依賴于不同的統(tǒng)計(jì)模型來(lái)計(jì)算P-values和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR），這意味著來(lái)自不同軟件包的顯著性不能直接比較。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)的peak calling閾值時(shí)，成功的實(shí)驗(yàn)通常會(huì)為哺乳動(dòng)物基因組中的大多數(shù)TF識(shí)別數(shù)千到數(shù)萬(wàn)個(gè)peaks。在所有情況下，在peak calling中使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照實(shí)驗(yàn)都很重要。
將離散的富集區(qū)域稱為廣源因子或混合源因子更具挑戰(zhàn)性，并且處于發(fā)展的早期階段。識(shí)別這些區(qū)域的方法正在出現(xiàn)（如ZINBA、MACS2、MACS的更新版本），專門用于處理混合信號(hào)類型。
 
參考文獻(xiàn)：
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