RNA-seq聯(lián)合ChIP-seq分析揭示肝臟p53依賴的組織特異性抗輻射機(jī)制
以前的研究發(fā)現(xiàn)胸腺和脾臟是體內(nèi)輻射敏感組織，而肝臟不是。胸腺和脾臟在體內(nèi)全身輻射后會觸發(fā)p53依賴性凋亡，但這種肝臟特異性抗性的分子機(jī)制尚不清楚。
2023年03月28日，美國西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院James J. Manfredi團(tuán)隊(duì)通過對經(jīng)輻射處理的小鼠器官進(jìn)行聯(lián)合RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析，鑒定出共有的和組織特異性p53轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，揭示了胸腺和脾臟共有的p53靶點(diǎn)富含凋亡靶點(diǎn)。且肝臟不能上調(diào)這些基因并不是因?yàn)榛蛘加新式档�。小鼠模型�?shí)驗(yàn)表明，p53的C末端缺失可導(dǎo)致肝內(nèi)p53凋亡靶點(diǎn)的輻射誘導(dǎo)表達(dá)，并伴隨細(xì)胞死亡增加。全面的RNA-seq分析顯示，C末端在肝臟特異性p53靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活中需要發(fā)揮額外作用。作者推測，抑制凋亡基因表達(dá)和增強(qiáng)肝臟特異性靶點(diǎn)激活都會導(dǎo)致組織特異性放射抵抗。相關(guān)研究成果以“In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity”為題發(fā)表在《Cell Reports》期刊（IF 8.8）。
研究要點(diǎn)：
圖形摘要
材料方法：
樣本處理：對21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠進(jìn)行2Gy精密X射線照射。X光照射的小鼠和年齡匹配的未受照射的對照小鼠在籠中保持3h。稱重21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠，在PBS（10μg/g體重）或PBS中腹腔注射100μl阿霉素。
方法：RNA提取、qRT-PCR、RNA-seq、ChIP-seq、TUNEL（通過標(biāo)記核酸末端檢測DNA片段）、免疫印跡。
研究結(jié)果：
（1）DNA損傷誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟的p53依賴性細(xì)胞凋亡，但不誘導(dǎo)肝臟凋亡
圖1：DNA 損傷在胸腺和脾臟中誘導(dǎo) p53 依賴性細(xì)胞凋亡，但不誘導(dǎo)肝臟凋亡，具有共有和組織特異性的 p53 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
圖1A：對野生型C57/BL6小鼠進(jìn)行2Gy的X射線照射6h，胸腺和脾臟出現(xiàn)大量的凋亡，而肝臟則沒有。
圖1B：使用p53基因缺失的小鼠進(jìn)行同樣處理，證明胸腺和脾臟的這些效應(yīng)確實(shí)是p53依賴性的。
圖1C：WB實(shí)驗(yàn)確定三種組織中p53的相對表達(dá)水平。照射3h后，p53在三種組織中的表達(dá)被誘導(dǎo)，6h后減弱。
圖1D：定量測量p53和actin條帶的相對強(qiáng)度表明，這三種組織中p53的表達(dá)水平?jīng)]有差異。然而，肝臟顯示出強(qiáng)大的p53靶基因反應(yīng)
圖1E/F：野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射線照射，進(jìn)行RNA-seq分析。
圖1G：對相應(yīng)組織進(jìn)行ChIP-seq分析，以確定p53的占據(jù)位點(diǎn)。
圖1H/I：整合RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)，挖掘表達(dá)水平顯著改變同時也有相關(guān)peak的基因，以鑒定真正的p53靶點(diǎn)。
（2）X射線誘導(dǎo)p53直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的共同核心集
圖2C：選擇了三個基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。Ccng1、Phlda3和Aen都上調(diào)了3-12倍，前兩個基因在每個組織中都明顯依賴于p53。
圖2D：在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的地方存在穩(wěn)健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在額外的峰。
圖2E：對所有20個共有基因的motif分析確定了一個的非常相似的motif。
圖2F：這些peak大部分位于p53本身或p53的上游，只有少數(shù)位于下游。
圖2G：GSEA顯示，GO_BP與先前與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的p53 DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的基因有關(guān)
（3）肝臟 p53 無法上調(diào)凋亡基因
圖3B：GSEA顯示與細(xì)胞凋亡相關(guān)的生物過程是富集率最高的。
圖3C：與凋亡過程基因集重疊的21個基因被證實(shí)其基因表達(dá)依賴于p53，并且在肝臟中不表達(dá)。
圖3D：qRT-PCR證實(shí)這些基因的一個子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾臟中確實(shí)是選擇性靶點(diǎn)，但在肝臟中不是，并且它們的表達(dá)依賴于p53。一個共同的靶點(diǎn)Cdkn1a在所有三個組織中作為p53依賴性基因表達(dá)的陽性對照。在10周齡小鼠中檢測Bbc3 (Puma)時，在蛋白和mRNA水平發(fā)現(xiàn)了類似的組織特異性。這就提出了一種可能性，即基因表達(dá)的組織特異性可能與對X射線的不同敏感性有關(guān)。
（4）無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少
圖4：無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少
圖4A：肝臟p53不能上調(diào)凋亡靶點(diǎn)的分子基礎(chǔ)可能是由于基因占據(jù)受損或DNA結(jié)合后。為解決這個問題，作者研究了三個關(guān)鍵凋亡靶標(biāo)（Bbc3、Pmaip1和Bax）的ChIP-seq圖譜。在照射胸腺和脾臟中，三個基因都觀察到強(qiáng)大的p53峰值。在肝臟中，這三個基因的p53占據(jù)率也相似
圖4B：為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，野生型p53小鼠體內(nèi)用另一種DNA損傷劑多柔比星處理，并對肝臟和脾臟組織進(jìn)行分析。進(jìn)行qRT-PCR檢測兩個共享靶標(biāo)Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并與兩個凋亡靶標(biāo)Bbc3和Pmaip1進(jìn)行比較。與X-射線照射后的結(jié)果一致，多柔比星處理導(dǎo)致肝臟和脾臟中Cdkn1a和Mdm2的增加，而Bbc3和Pmaip1僅在脾臟中被誘導(dǎo)。
圖4C：對相應(yīng)的肝臟和脾臟組織樣本進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。與X-射線的結(jié)果一樣，多柔比星處理后，在肝臟和脾臟的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反應(yīng)元件上檢測到p53的占據(jù)，Alb基因的一個區(qū)域被用作陰性對照
（5）肝臟p53靶基因表達(dá)缺陷有兩種機(jī)制
圖5：肝臟p53靶基因表達(dá)缺陷有兩種機(jī)制
圖5A：然后研究了80個胸腺和脾臟靶點(diǎn)中有多少具有類似的特性，即它們也被p53占據(jù)但在肝臟中不被上調(diào)。
圖5B：與胸腺和脾臟相比，這些基因在肝臟中的占據(jù)率在統(tǒng)計學(xué)上更高。兩個代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq圖譜顯示，p53在所有三個組織中都有很強(qiáng)的占據(jù)率。80個基因中有74個被肝臟p53占據(jù)，其中所有與GO凋亡過程基因組重疊的基因都在這里被發(fā)現(xiàn)。這些峰值主要出現(xiàn)在上游區(qū)域。將這些峰中的p53 motif進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們與之前確定的p53共識有合理的匹配。
圖5C：其余6個基因在肝臟中沒有與之相關(guān)的穩(wěn)健的p53 ChIP峰。展示了ChIP-seq圖譜的兩個例子（Hgfac和Dcaf4）。在胸腺和脾臟中發(fā)現(xiàn)的這些峰值，但在肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)，這些峰也大多出現(xiàn)在基因體內(nèi)。這些峰中的p53 motif也與p53共識相似。
（6）p53的C末端阻止肝臟中p53細(xì)胞凋亡靶標(biāo)的上調(diào)
圖6：內(nèi)源性Trp53基因表達(dá)了一個缺少最后24個氨基酸的截短蛋白。對p53Δ24/-小鼠進(jìn)行X-射線處理并分析p53靶點(diǎn)的表達(dá)。與p53+/-小鼠相比，Δ24/-小鼠肝臟、胸腺和脾臟中某些p53靶點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行了檢測。
圖6A：CTD的缺失對胸腺/脾臟中共有靶點(diǎn)Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾臟特異靶點(diǎn)Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表達(dá)沒有實(shí)質(zhì)性影響。相反缺失CTD后，肝臟中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，但Bax的誘導(dǎo)作用不增強(qiáng)。
圖6B：輻射后p53+/-肝臟中mRNA幾乎沒有變化的Bbc3，在p53Δ24/-肝臟中被輻射誘導(dǎo)。
圖6C：WB以確定CTD的缺失是否改變了p53蛋白的表達(dá)。多個蛋白定量證實(shí)不同組織的p53水平相當(dāng)。p53蛋白水平的誘導(dǎo)在不同組織和基因型中同樣相似。與p53Δ24/-肝臟中Bbc3 mRNA的誘導(dǎo)一致，Puma蛋白也被強(qiáng)有力地誘導(dǎo)，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6B和6C）。因此，CTD的缺失允許肝臟特異性上調(diào)凋亡靶標(biāo)，特別是在輻射處理后的Bbc3。
（7）p53的C端阻止X射線誘導(dǎo)的肝臟凋亡
圖7A右：對多個實(shí)驗(yàn)中的此類顯微照片進(jìn)行定量顯示增加了7倍，這與CTD缺失增強(qiáng)肝臟輻射敏感性的觀點(diǎn)一致。
圖7L/M：GSEA顯示，這兩組基因（CTD需要表達(dá)的基因和CTD抑制表達(dá)的基因）具有不同的生物學(xué)過程。
參考文獻(xiàn)：
Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. pii: S2211-1247(23)00227-9. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. PubMed PMID: 36924496.
2023年03月28日，美國西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院James J. Manfredi團(tuán)隊(duì)通過對經(jīng)輻射處理的小鼠器官進(jìn)行聯(lián)合RNA測序（RNA-seq）和染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）分析，鑒定出共有的和組織特異性p53轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，揭示了胸腺和脾臟共有的p53靶點(diǎn)富含凋亡靶點(diǎn)。且肝臟不能上調(diào)這些基因并不是因?yàn)榛蛘加新式档�。小鼠模型�?shí)驗(yàn)表明，p53的C末端缺失可導(dǎo)致肝內(nèi)p53凋亡靶點(diǎn)的輻射誘導(dǎo)表達(dá)，并伴隨細(xì)胞死亡增加。全面的RNA-seq分析顯示，C末端在肝臟特異性p53靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄激活中需要發(fā)揮額外作用。作者推測，抑制凋亡基因表達(dá)和增強(qiáng)肝臟特異性靶點(diǎn)激活都會導(dǎo)致組織特異性放射抵抗。相關(guān)研究成果以“In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity”為題發(fā)表在《Cell Reports》期刊（IF 8.8）。
研究要點(diǎn)：
- RNA-seq和ChIP-seq顯示p53輻射反應(yīng)具有共有性和組織特異性
- 肝臟p53靶向凋亡靶基因，但不能調(diào)控其表達(dá)
- p53C末端抑制肝細(xì)胞凋亡基因，具有放射抗性
- p53C末端是肝臟特異性基因?qū)椛浞磻?yīng)所必需的
圖形摘要
材料方法：
樣本處理：對21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠進(jìn)行2Gy精密X射線照射。X光照射的小鼠和年齡匹配的未受照射的對照小鼠在籠中保持3h。稱重21日齡不同基因型C57/Bl6小鼠，在PBS（10μg/g體重）或PBS中腹腔注射100μl阿霉素。
方法：RNA提取、qRT-PCR、RNA-seq、ChIP-seq、TUNEL（通過標(biāo)記核酸末端檢測DNA片段）、免疫印跡。
研究結(jié)果：
（1）DNA損傷誘導(dǎo)小鼠胸腺和脾臟的p53依賴性細(xì)胞凋亡，但不誘導(dǎo)肝臟凋亡
圖1：DNA 損傷在胸腺和脾臟中誘導(dǎo) p53 依賴性細(xì)胞凋亡，但不誘導(dǎo)肝臟凋亡，具有共有和組織特異性的 p53 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
圖1B：使用p53基因缺失的小鼠進(jìn)行同樣處理，證明胸腺和脾臟的這些效應(yīng)確實(shí)是p53依賴性的。
圖1C：WB實(shí)驗(yàn)確定三種組織中p53的相對表達(dá)水平。照射3h后，p53在三種組織中的表達(dá)被誘導(dǎo)，6h后減弱。
圖1D：定量測量p53和actin條帶的相對強(qiáng)度表明，這三種組織中p53的表達(dá)水平?jīng)]有差異。然而，肝臟顯示出強(qiáng)大的p53靶基因反應(yīng)
圖1E/F：野生型和p53缺失小鼠均未接受或接受2 Gy的X射線照射，進(jìn)行RNA-seq分析。
圖1G：對相應(yīng)組織進(jìn)行ChIP-seq分析，以確定p53的占據(jù)位點(diǎn)。
圖1H/I：整合RNA-seq與ChIP-seq數(shù)據(jù)，挖掘表達(dá)水平顯著改變同時也有相關(guān)peak的基因，以鑒定真正的p53靶點(diǎn)。
（2）X射線誘導(dǎo)p53直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)的共同核心集
圖2：X輻射誘導(dǎo)一組共有的p53直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)核心
圖2A/B：圖1H發(fā)現(xiàn)，20個基因在三種組織中均顯著上調(diào)，且在基因的10 kb范圍內(nèi)至少有一個peak。這20個基因的上調(diào)在所有受檢組織中都依賴于p53。圖2C：選擇了三個基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。Ccng1、Phlda3和Aen都上調(diào)了3-12倍，前兩個基因在每個組織中都明顯依賴于p53。
圖2D：在靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的地方存在穩(wěn)健的峰，且在Phlda3中，在基因上游存在額外的峰。
圖2E：對所有20個共有基因的motif分析確定了一個的非常相似的motif。
圖2F：這些peak大部分位于p53本身或p53的上游，只有少數(shù)位于下游。
圖2G：GSEA顯示，GO_BP與先前與導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的p53 DNA損傷應(yīng)答相關(guān)的基因有關(guān)
（3）肝臟 p53 無法上調(diào)凋亡基因
圖3：肝臟p53無法上調(diào)凋亡基因
圖3A：為闡明胸腺和脾臟與肝臟對輻射的不同生物反應(yīng)的基礎(chǔ)，確定了敏感組織中特異性上調(diào)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80個基因在胸腺和脾臟中的表達(dá)在輻射后增加，而在肝臟中沒有變化。所有這80個基因都有與之相關(guān)的ChIP峰，并被認(rèn)為是p53的真正靶標(biāo)。圖3B：GSEA顯示與細(xì)胞凋亡相關(guān)的生物過程是富集率最高的。
圖3C：與凋亡過程基因集重疊的21個基因被證實(shí)其基因表達(dá)依賴于p53，并且在肝臟中不表達(dá)。
圖3D：qRT-PCR證實(shí)這些基因的一個子集（Bbc3、Pmaip1和Bax）在胸腺和脾臟中確實(shí)是選擇性靶點(diǎn)，但在肝臟中不是，并且它們的表達(dá)依賴于p53。一個共同的靶點(diǎn)Cdkn1a在所有三個組織中作為p53依賴性基因表達(dá)的陽性對照。在10周齡小鼠中檢測Bbc3 (Puma)時，在蛋白和mRNA水平發(fā)現(xiàn)了類似的組織特異性。這就提出了一種可能性，即基因表達(dá)的組織特異性可能與對X射線的不同敏感性有關(guān)。
（4）無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少
圖4：無法上調(diào)肝臟中的p53凋亡靶點(diǎn)不是由于基因占用減少
圖4B：為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，野生型p53小鼠體內(nèi)用另一種DNA損傷劑多柔比星處理，并對肝臟和脾臟組織進(jìn)行分析。進(jìn)行qRT-PCR檢測兩個共享靶標(biāo)Cdkn1a和Mdm2的mRNA水平，并與兩個凋亡靶標(biāo)Bbc3和Pmaip1進(jìn)行比較。與X-射線照射后的結(jié)果一致，多柔比星處理導(dǎo)致肝臟和脾臟中Cdkn1a和Mdm2的增加，而Bbc3和Pmaip1僅在脾臟中被誘導(dǎo)。
圖4C：對相應(yīng)的肝臟和脾臟組織樣本進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀。與X-射線的結(jié)果一樣，多柔比星處理后，在肝臟和脾臟的Cdkn1a、Bbc3和Mdm2基因的反應(yīng)元件上檢測到p53的占據(jù)，Alb基因的一個區(qū)域被用作陰性對照
（5）肝臟p53靶基因表達(dá)缺陷有兩種機(jī)制
圖5：肝臟p53靶基因表達(dá)缺陷有兩種機(jī)制
圖5B：與胸腺和脾臟相比，這些基因在肝臟中的占據(jù)率在統(tǒng)計學(xué)上更高。兩個代表性基因（Notch1, Ei24）的ChIP-seq圖譜顯示，p53在所有三個組織中都有很強(qiáng)的占據(jù)率。80個基因中有74個被肝臟p53占據(jù)，其中所有與GO凋亡過程基因組重疊的基因都在這里被發(fā)現(xiàn)。這些峰值主要出現(xiàn)在上游區(qū)域。將這些峰中的p53 motif進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)它們與之前確定的p53共識有合理的匹配。
圖5C：其余6個基因在肝臟中沒有與之相關(guān)的穩(wěn)健的p53 ChIP峰。展示了ChIP-seq圖譜的兩個例子（Hgfac和Dcaf4）。在胸腺和脾臟中發(fā)現(xiàn)的這些峰值，但在肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)，這些峰也大多出現(xiàn)在基因體內(nèi)。這些峰中的p53 motif也與p53共識相似。
（6）p53的C末端阻止肝臟中p53細(xì)胞凋亡靶標(biāo)的上調(diào)
圖6A：CTD的缺失對胸腺/脾臟中共有靶點(diǎn)Cdkn1a和Mdm2或胸腺/脾臟特異靶點(diǎn)Bbc3、Pmaip1和Bax的基因表達(dá)沒有實(shí)質(zhì)性影響。相反缺失CTD后，肝臟中Cdkn1a、Bbc3、Pmaip1和Mdm2的誘導(dǎo)作用增強(qiáng)，但Bax的誘導(dǎo)作用不增強(qiáng)。
圖6B：輻射后p53+/-肝臟中mRNA幾乎沒有變化的Bbc3，在p53Δ24/-肝臟中被輻射誘導(dǎo)。
圖6C：WB以確定CTD的缺失是否改變了p53蛋白的表達(dá)。多個蛋白定量證實(shí)不同組織的p53水平相當(dāng)。p53蛋白水平的誘導(dǎo)在不同組織和基因型中同樣相似。與p53Δ24/-肝臟中Bbc3 mRNA的誘導(dǎo)一致，Puma蛋白也被強(qiáng)有力地誘導(dǎo)，并具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖6B和6C）。因此，CTD的缺失允許肝臟特異性上調(diào)凋亡靶標(biāo)，特別是在輻射處理后的Bbc3。
（7）p53的C端阻止X射線誘導(dǎo)的肝臟凋亡
圖7：p53的C末端可防止X射線誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞凋亡，并確定肝臟特異性基因表達(dá)
圖7A：為觀察CTD缺失后觀察到的基因表達(dá)變化是否會影響X射線治療后的生物學(xué)結(jié)果，對p53+/-和p53Δ24/-小鼠的肝組織進(jìn)行了TUNEL檢測。顯微照片證實(shí)p53+/-肝臟在輻射前后幾乎沒有TUNEL陽性。相反，p53Δ24/-肝臟顯示TUNEL陽性細(xì)胞增加。圖7A右：對多個實(shí)驗(yàn)中的此類顯微照片進(jìn)行定量顯示增加了7倍，這與CTD缺失增強(qiáng)肝臟輻射敏感性的觀點(diǎn)一致。
圖7L/M：GSEA顯示，這兩組基因（CTD需要表達(dá)的基因和CTD抑制表達(dá)的基因）具有不同的生物學(xué)過程。
參考文獻(xiàn)：
Resnick-Silverman L, Zhou R, Campbell MJ, Leibling I, Parsons R, Manfredi JJ. In vivo RNA-seq and ChIP-seq analyses show an obligatory role for the C terminus of p53 in conferring tissue-specific radiation sensitivity. Cell Rep. 2023 Mar 28;42(3):112216. pii: S2211-1247(23)00227-9. doi: 10.1016/j.celrep.2023.112216. PubMed PMID: 36924496.
標(biāo)簽：
RNA甲基化
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