應(yīng)用DAP-seq技術(shù)助力揭示GhRCD1促進(jìn)棉花對(duì)鎘的耐受能力

鎘（Cd²⁺）是環(huán)境中最常見的有害重金屬之一，嚴(yán)重威脅作物生產(chǎn)力和質(zhì)量以及食品安全。Cd²⁺容易被植物從土壤中吸收，并通過(guò)可食用的植物器官和谷物進(jìn)入食物鏈，對(duì)食品質(zhì)量、糧食安全和公共安全構(gòu)成威脅。
植物修復(fù)是減少土壤污染的有效途徑之一。棉花作為一種重要的非食用經(jīng)濟(jì)作物，與糧食作物（小麥、水稻和玉米）、油料作物（花生和大豆）和蔬菜（豆類、黃瓜和番茄）相比，在修復(fù)土壤Cd²⁺污染方面具有天然優(yōu)勢(shì)，避免了Cd²⁺進(jìn)入食物鏈的風(fēng)險(xiǎn)。因此，探究棉花響應(yīng)鎘脅迫的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。
2024年1月16日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所李付廣研究員團(tuán)隊(duì)的研究成果，發(fā)表在Plant Biotechnology Journal期刊上（IF=13.8），文章題目是“GhRCD1 promotes cotton tolerance to cadmium by regulating the GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1 transcriptional cascade” 。該研究使用DNA親和純化測(cè)序（DAP-seq）等分子相互作用研究方法，發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)棉花Cd²⁺耐受性的分子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，揭示了GhRCD1通過(guò)調(diào)控GhbHLH12-GhMYB44-GhHMA1轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)通路響應(yīng)鎘脅迫的分子機(jī)制，為培育耐鎘棉花新品種和通過(guò)植物修復(fù)手段降低鎘污染提供了新思路。

為探究Cd²⁺對(duì)棉花毒性的分子機(jī)制，作者通過(guò)T-DNA插入得到對(duì)Cd²⁺敏感的突變體ghrcd1。Cd²⁺處理后，通過(guò)表型觀察，RT-qPCR分析，PI染色，葉綠體結(jié)構(gòu)觀察，SPAD分析等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ghrcd1幼苗比WT植株表現(xiàn)出更低的Cd²⁺耐受性，這表明，抑制GhRCD1表達(dá)會(huì)降低棉花Cd²⁺耐受性，GhRCD1在棉花應(yīng)對(duì)鎘脅迫時(shí)具有正向調(diào)節(jié)作用。

作者使用GhRCD1為誘餌蛋白，對(duì)棉花應(yīng)激響應(yīng)蛋白庫(kù)進(jìn)行Y2H篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GhbHLH12轉(zhuǎn)錄因子與GhRCD1存在相互作用。而后通過(guò)BiFC、GST pull down和LCI實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果。這些結(jié)果表明GhRCD1與GhbHLH12在體外和體內(nèi)都能與GhbHLH12相互作用。

為探究GhbHLH12是否參與了棉花應(yīng)對(duì)Cd²⁺脅迫的反應(yīng)，作者構(gòu)建了棉花的OE-GhbHLH12株系和GhbHLH1-RNAi株系。Cd²⁺處理后，GhbHLH1-RNAi的Cd²⁺耐受性增加，OE-GhbHLH12的Cd²⁺耐受性降低。為確定GhbHLH12在調(diào)節(jié)Cd²⁺耐受性中是否有基因依賴性，作者敲除GhbHLH12得到KO-GhbHLH12株系，Cd²⁺處理后，KO-GhbHLH12植株比對(duì)照植株具有更高的耐受性。這些結(jié)果說(shuō)明，抑制GhbHLH12表達(dá)增強(qiáng)了棉花的Cd²⁺耐受性。

為探究GhbHLH12抑制棉花Cd²⁺耐受性的機(jī)制，作者對(duì)WT幼苗進(jìn)行了RNA-seq和DAP-seq聯(lián)合分析。DAP-seq結(jié)果顯示GhbHLH12在GhMYB44的啟動(dòng)子區(qū)域有顯著富集，而后，Y1H和EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GhbHLH12蛋白和GhMYB44的結(jié)合基序G-box相互作用。LUC/REN報(bào)告實(shí)驗(yàn)表明GhbHLH12抑制GhMYB44的轉(zhuǎn)錄，而GhRCD1可以減弱GhbHLH12對(duì)GhMYB44的抑制作用，EMSA結(jié)果也表明GhRCD1減弱了GhbHLH12與GhMYB44的結(jié)合，結(jié)合RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明GhRCD1和GhbHLH12分別是Cd²⁺耐受性的正負(fù)調(diào)節(jié)因子，并且在Cd²⁺脅迫下，轉(zhuǎn)錄調(diào)控存在復(fù)雜的相互作用。

為探究GhMYB44響應(yīng)Cd²⁺脅迫的機(jī)制，作者構(gòu)建了GhMYB44-OE1/5株系和GhMYB44-SRDX1/6株系。Cd²⁺處理后，與WT相比，GhMYB44-OE表現(xiàn)出更高的Cd²⁺耐受性，而SRDX-GhMYB44-1/6植株表現(xiàn)出更低的耐受性。這表明GhMYB44表達(dá)增強(qiáng)了棉花的Cd²⁺耐受性。隨后作者采用VIGS技術(shù)沉默對(duì)照和KO-GhbHLH12株系中的GhMYB44基因，結(jié)果表明GhMYB44在GhbHLH12的下游發(fā)揮作用。

為探究棉花中GhMYB44提高Cd²⁺耐受性的作用機(jī)制，作者利用DAP-seq技術(shù)找到GhMYB44的10207個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，其中61.42％位于基因間區(qū)，22.31％位于啟動(dòng)子區(qū)。GO分析顯示，靶基因顯著富集在脅迫應(yīng)答（GhWRKY13和GhWRKY51）和金屬離子結(jié)合和運(yùn)輸（GhHMA1、GhHMA2和GhHMA5）通路。為研究GhMYB44是否通過(guò)GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮調(diào)控作用，作者通過(guò)Y1H、EMSA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了GhMYB44特異性結(jié)合GhHMA１和GhHMA5的G-box（CATGTG）順式作用元件。LUC/REN報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GhMYB44可以直接激活GhHMA1和GhHMA5的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)控Cd²⁺的轉(zhuǎn)運(yùn)。RT-qPCR分析表明Cd²⁺誘導(dǎo)GhHMA1和GhHMA5的上調(diào)在很大程度上取決于GhMYB44和KO-bHLH12的存在和功能。
為進(jìn)一步探究GhHMA1和GhHMA5在Cd²⁺耐受機(jī)制中的生物功能，作者采用VIGS技術(shù)沉默棉花中的GhHMA1和GhHMA5基因，生成沉默品系，Cd²⁺處理后，沉默品系對(duì)Cd²⁺表現(xiàn)出更高的敏感性。結(jié)果表明GhMYB44-GhHMA1/5信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)正向調(diào)控棉花的Cd²⁺耐受性。

 8.GhMYB44和GhPYL8協(xié)同調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的Cd²⁺耐受性
為研究GhMYB44是否與ABA受體相互作用介導(dǎo)Cd²⁺耐受性，作者進(jìn)行Y2H測(cè)定發(fā)現(xiàn)GhMYB44與ABA受體GhPYL8相互作用。隨后通過(guò)BiFC和蛋白pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)果。為研究GhPYL8的生理功能，作者構(gòu)建了OE-GhPYL8-1/3/6株系，Cd²⁺處理后，與WT相比，OE - GhPYL8對(duì)Cd²⁺的耐受性更高。這些結(jié)果表明GhMYB44可以與GhPYL8相互作用來(lái)調(diào)節(jié)ABA介導(dǎo)的Cd²⁺耐受性。