ChIP-seq等揭示c-di-AMP與DasR互作以調(diào)控細(xì)菌生長、發(fā)育和抗生素合成

c-di-AMP是一種在細(xì)菌信號(hào)中普遍存在且至關(guān)重要的核苷酸第二信使，對(duì)于大多數(shù)c-di-AMP合成生物體來說，c-di-AMP穩(wěn)態(tài)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制非常值得關(guān)注。
 
2024年5月7日，華東理工大學(xué)尤迪副研究員為第一作者和通訊作者、葉邦策教授為共同通訊在《Nature Communications》期刊發(fā)表題為“Allosteric regulation by c-di-AMP modulates a complete N-acetylglucosamine signaling cascade in Saccharopolyspora erythraea”的研究論文，該研究將生產(chǎn)紅霉素的紅霉素生產(chǎn)菌（紅霉糖多孢菌，Saccharopolyspora erythraea，S. erythraea）中的DasR鑒定為c-di-AMP的靶標(biāo)，從而揭示c-di-AMP與該細(xì)菌中GlcNAc信號(hào)之間的直接聯(lián)系。研究還表明c-di-AMP結(jié)合刺激了DasR介導(dǎo)的GlcNAc攝取和利用抑制，并描述了c-di-AMP介導(dǎo)形成c-di-AMP連接的DasR二聚體形成的分子機(jī)制。由于GntR家族調(diào)控因子以二聚體形式與DNA互作，因此DasR的有效二聚體化激活了DasR對(duì)其目標(biāo)調(diào)控子的調(diào)節(jié)。具體來說，DAC活性受到DasR的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，從而形成調(diào)控環(huán)，調(diào)控從營養(yǎng)狀態(tài)到形態(tài)分化和抗生素合成的完整信號(hào)級(jí)聯(lián)。最后，系統(tǒng)發(fā)育分析和體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，c-di-AMP通過變構(gòu)調(diào)節(jié)發(fā)揮全局調(diào)控作用，并通過DasR介導(dǎo)的信號(hào)整合在產(chǎn)生c-di-AMP的放線菌中可能是保守且必需的。
 

標(biāo)題：Allosteric regulation by c-di-AMP modulates a complete N-acetylglucosamine signaling cascade in Saccharopolyspora erythraea
中文標(biāo)題：c-di-AMP的變構(gòu)調(diào)節(jié)可以全局調(diào)控糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea）中完整的N-乙酰葡糖胺信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)
時(shí)間：2024-05-07
期刊：Nature Communications
影響因子：IF 16.6 / Q1
技術(shù)平臺(tái)：EMSA 、ChIP-seq、qRT-PCR、BLI實(shí)驗(yàn)、ITC實(shí)驗(yàn)、CD實(shí)驗(yàn)、酶法實(shí)驗(yàn)、過表達(dá)實(shí)驗(yàn)、化學(xué)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)等
 

摘要：
本研究揭示了c-di-AMP與感應(yīng)N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）調(diào)節(jié)因子DasR的結(jié)合，表明c-di-AMP和GlcNAc信號(hào)之間存在直接關(guān)聯(lián)。GlcNAc不僅在細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)中扮演基礎(chǔ)性角色，還作為一種調(diào)控從細(xì)菌到人類多種細(xì)胞過程的主要營養(yǎng)物質(zhì)和信使分子。研究還表明，增加的c-di-AMP水平能夠變構(gòu)激活DasR，使其作為GlcNAc利用的主要抑制因子，抑制DasR介導(dǎo)的GlcNAc信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并導(dǎo)致紅霉素生產(chǎn)菌（Saccharopolyspora erythraea）發(fā)育轉(zhuǎn)換和抗生素合成的一致性增強(qiáng)。編碼diadenylate環(huán)化酶disA基因表達(dá)直接受DasR調(diào)控因子抑制，以響應(yīng)GlcNAc信號(hào)，從而形成c-di-AMP合成自我維持的轉(zhuǎn)錄反饋環(huán)。本研究結(jié)果揭示了c-di-AMP的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，它在細(xì)菌中的全局信號(hào)整合和c-di-AMP穩(wěn)態(tài)中似乎發(fā)揮著重要作用，很可能在產(chǎn)生c-di-AMP的鏈霉菌中廣泛存在。
 

圖形摘要：c-di-AMP和GlcNAc信號(hào)串?dāng)_工作模型。該模型總結(jié)GlcNAc可用性變化過程中c-di-AMP水平變化及其對(duì)DasR活性信號(hào)作用，從而揭示DasR下游調(diào)控發(fā)育和抗生素生物合成的調(diào)控級(jí)聯(lián)反應(yīng)。箭頭表示陽性對(duì)照。垂直線表示陰性對(duì)照。

研究結(jié)果：
（1）c-di-AMP影響GlcNAc利用率和GlcNAc觸發(fā)響應(yīng)

圖1：液體TSB培養(yǎng)基中生長的野生型(WT)和DisA過表達(dá)(OdisA)菌株的disA基因轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP濃度實(shí)驗(yàn)

a.   在指數(shù)生長后期(48h)，檢測了WT和OdisA菌株中disA基因的轉(zhuǎn)錄水平和細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP濃度。對(duì)WT菌株表達(dá)水平或c-di-AMP水平進(jìn)行倍數(shù)變化表示。樣品中的c-di-AMP濃度被標(biāo)準(zhǔn)化為干細(xì)胞重量。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)的形式呈現(xiàn)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)(n=3)。
b.   30°C條件下，添加葡萄糖的液體TSB培養(yǎng)基中生長的S. erythraea WT和OdisA菌株的生長曲線。
c.   同樣條件下，WT和OdisA菌株的GlcNAc利用情況。實(shí)線表示生長曲線，虛線表示GlcNAc的利用情況。
d-e.  在營養(yǎng)豐富的R2YE瓊脂平板上生長168h的WT和OdisA菌株表型，包括在添加葡萄糖(d)或GlcNAc(e)情況。
f-g． 通過SEM檢查了在添加葡萄糖(f)或GlcNAc(g)的R2YE瓊脂平板上生長72h的WT和OdisA菌株的形態(tài)。
h.    高效液相色譜法(HPLC)對(duì)WT和OdisA菌株產(chǎn)生的紅霉素進(jìn)行定量分析。紅霉素從在30°C下生長120小時(shí)的50 ml TSB培養(yǎng)基中的菌落中提取。
 
（2）GlcNAc敏感蛋白DasR是一種c-di-AMP效應(yīng)蛋白

圖2：c-di-AMP是DasR-DNA結(jié)合的變構(gòu)激活劑

 
（3）c-di-AMP誘導(dǎo)DasR與其靶標(biāo)基因結(jié)合的整體結(jié)果
為在細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證并擴(kuò)展c-di-AMP的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用，研究人員利用染色質(zhì)免疫沉淀測序（ChIP-seq）來分析在紅霉素產(chǎn)生菌Saccharopolyspora erythraea中c-di-AMP升高對(duì)DasR依賴的全基因組影響。野生型S. erythraea和DisA過表達(dá)菌株在TSB液體培養(yǎng)基中生長，并使用特定的抗DasR抗體進(jìn)行ChIP-seq實(shí)驗(yàn)。每個(gè)菌株的總input DNA（非免疫沉淀）也進(jìn)行測序。WT和OdisA信號(hào)在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）廣泛分布，呈現(xiàn)出顯著尖銳的單一peak（圖3a）。與WT對(duì)照相比，OdisA菌株中約99% peaks表現(xiàn)出在DasR靶標(biāo)啟動(dòng)子處ChIP-seq peaks高度增強(qiáng)，證實(shí)OdisA菌株中占有率升高（圖3b）�？傮w而言，通過可視化和驗(yàn)證在高c-di-AMP水平暴露下相關(guān)基因的代表性結(jié)果，展示個(gè)別基因水平上ChIP-seq peaks值變化（圖3c）。對(duì)增強(qiáng)結(jié)合信號(hào)基因進(jìn)行GO和KEGG通路分析，表明在抗生素生物合成過程、碳氮和丙酮酸代謝以及多樣環(huán)境中的微生物代謝方面富集（圖3d）。這些結(jié)果進(jìn)一步證明c-di-AMP確實(shí)增強(qiáng)了DasR與其體內(nèi)靶標(biāo)基因的結(jié)合。DasR是GlcNAc信號(hào)中的GlcNAc效應(yīng)蛋白和主要調(diào)控因子，直接抑制GlcNAc代謝基因表達(dá)。為直接檢測這種對(duì)DasR介導(dǎo)抑制的增強(qiáng)，通過實(shí)時(shí)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄，對(duì)包括nagK、nagB-II、nagA、nagF和nagE2在內(nèi)的GlcNAc同化相關(guān)基因進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果與ChIP-seq數(shù)據(jù)一致，所選基因的抑制在OdisA中顯著增強(qiáng)（圖3e）。然而ΔdasR::disA菌株結(jié)果表明，在dasR缺失條件下，c-di-AMP對(duì)GlcNAc同化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄沒有影響，表明c-di-AMP通過DasR調(diào)控GlcNAc同化。數(shù)據(jù)驗(yàn)證了先前結(jié)果，即過量c-di-AMP可抑制GlcNAc同化，從而影響GlcNAc向形態(tài)發(fā)育和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生信號(hào)。這一分析有助于通過其與DasR的功能性關(guān)聯(lián)，對(duì)c-di-AMP相對(duì)未知作用進(jìn)行注釋。
 

圖3：c-di-AMP在體內(nèi)刺激DasR介導(dǎo)對(duì)其目標(biāo)調(diào)控子抑制

a.  peak中心和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSSs)±3kb處的ChIP-seq信號(hào)密度熱圖。紅色表示信號(hào)低，藍(lán)色表示信號(hào)高。
b.  特定菌株中的ChIP-seq信號(hào)。
c.  特定菌株中disA啟動(dòng)子區(qū)域的ChIP-seq信號(hào)IGV軌跡圖。
d.  網(wǎng)絡(luò)中上調(diào)靶基因富集的GO和KEGG分析。
e.  在液體TSB培養(yǎng)基中生長的S. erythraea WT、OdisA、ΔdasR和ΔdasR::disA菌株在晚期指數(shù)生長期(48h)的特定基因轉(zhuǎn)錄水平。倍數(shù)變化表示與WT菌株相比的轉(zhuǎn)錄水平。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。使用普通單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。
 
（4）DasR通過直接轉(zhuǎn)錄抑制disA影響細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP水平
根據(jù)ChIP-seq分析，disA被鑒定為DasR的潛在基因靶標(biāo)（圖3c）。放線菌中的DasR響應(yīng)元件（dre）在先前的研究中已被鑒定，并且在S. erythraea的disA基因上游區(qū)域鑒定出五個(gè)以上的推測dre位點(diǎn)（圖4a）。為驗(yàn)證DasR是否可以直接結(jié)合disA上游區(qū)域，進(jìn)行電泳遷移率變化分析（EMSA）。與純化的His標(biāo)記的DasR共孵育后觀察到明顯的條帶遷移（圖4b），表明DasR特異性結(jié)合disA啟動(dòng)子區(qū)域。隨后使用野生型（WT）S. erythraea菌株、dasR缺失菌株（ΔdasR）、dasR補(bǔ)充菌株（CdasR）和過表達(dá)dasR的WT菌株（OdasR），來檢測DasR是否對(duì)disA有調(diào)控作用。通過實(shí)時(shí)RT-PCR檢測這四個(gè)菌株中的disA轉(zhuǎn)錄水平。如圖4c所示，與WT菌株相比，dasR缺失導(dǎo)致了disA轉(zhuǎn)錄約增加三倍，dasR補(bǔ)充菌株中的disA轉(zhuǎn)錄水平與WT菌株相似，而過表達(dá)dasR的WT菌株中disA表達(dá)減少約60%。因此，DasR在S. erythraea中直接抑制disA轉(zhuǎn)錄。
細(xì)菌c-di-AMP合成由DisA的DAC活性催化。為研究DasR是否影響S. erythraea的c-di-AMP合成，作者分析了WT、ΔdasR、CdasR和OdasR菌株的細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP水平和總DisA DAC活性。與WT菌株相比，ΔdasR菌株細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP水平增加兩倍以上，而OdasR菌株的c-di-AMP合成減少40%以上（圖4d）。通過HPLC實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞提取物中的總DisA DAC活性，驗(yàn)證了c-di-AMP合成由DasR直接調(diào)控。結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP水平一致，表明dasR缺失導(dǎo)致DisA DAC活性增加兩倍（圖4d）。因此，結(jié)合c-di-AMP誘導(dǎo)DasR-DNA結(jié)合變構(gòu)激活的觀察結(jié)果，綜合數(shù)據(jù)揭示了細(xì)胞內(nèi)c-di-AMP池的自反饋循環(huán)工作模型。
 

圖4：DasR和GlcNAc影響S. erythraea中c-di-AMP合成。

（5）c-di-AMP 和 DasR 之間的變構(gòu)調(diào)節(jié)在 S. coelicolor 中保守

圖5：c-di-AMP與DasR互作在S. coelicolor中保守

a.  原核生物中DasR蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析。
b.  DasR響應(yīng)元件(dre)S. coelicolor DasR和S. erythraea DasR的元件。
c.  S. coelicolor disA啟動(dòng)子區(qū)域的dre。
d.  對(duì)S. coelicolor的disA啟動(dòng)子區(qū)域純化的DasR的EMSA。
e.  c-di-AMP特異性刺激S. coelicolor DasR-DNA結(jié)合的EMSA。
f.   ITC對(duì)c-di-AMP與DasRSco互作進(jìn)行表征。
g.  DasRSco與其靶基因disA啟動(dòng)子結(jié)合的EMSA。

參考文獻(xiàn)：
You D, Zhao LC, Fu Y, Peng ZY, Chen ZQ, Ye BC. Allosteric regulation by c-di-AMP modulates a complete N-acetylglucosamine signaling cascade in Saccharopolyspora erythraea. Nat Commun. 2024 May 7;15(1):3825. pii: 10.1038/s41467-024-48063-0. doi: 10.1038/s41467-024-48063-0. PubMed PMID: 38714645.