單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示蛋白酪氨酸激酶在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用

期刊：Signal Transduction and Targeted Therapy
影響因子：38.104
主要技術(shù)：單細(xì)胞測(cè)序

導(dǎo)語(yǔ)
腺瘤到癌的發(fā)展是一個(gè)被廣泛接受的散發(fā)性結(jié)直腸癌的發(fā)展路線。然而，異常上皮細(xì)胞的細(xì)胞異質(zhì)性限制了我們對(duì)結(jié)直腸組織癌變的理解。本研究對(duì)來(lái)自患者匹配的組織樣本的54,788個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序調(diào)查，包括血液、正常組織、癌旁、息肉和結(jié)腸直腸癌。在癌變的每個(gè)階段，描述了不同細(xì)胞群的細(xì)胞類型、轉(zhuǎn)錄特征和差異表達(dá)基因。上皮細(xì)胞在正常、良性和惡性階段的分子特征。腺瘤和癌的前體細(xì)胞群被鑒定和特征化，然后通過(guò)大隊(duì)列活檢進(jìn)行驗(yàn)證。

研究技術(shù)
單細(xì)胞測(cè)序

研究結(jié)果
1.結(jié)直腸正常組織、腺瘤和癌組織的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析
為了動(dòng)態(tài)地分析正常腺瘤-癌序列中每種細(xì)胞類型的進(jìn)化和分子特征，使用scRNA-seq技術(shù)對(duì)每個(gè)細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析（圖1a）。我們同時(shí)采集了同一例接受根治性手術(shù)的患者的血液、正常、癌旁、息肉和癌組織樣本（圖1b）。從4例未經(jīng)治療的CRC患者中收集了12例組織樣本。通過(guò)H&E染色證實(shí)了其病理情況（即腺瘤和癌）（補(bǔ)充圖1a)。通過(guò)體細(xì)胞變異分析，在患者匹配的腺瘤和癌中觀察到多個(gè)突變（圖1c）。這種遺傳相似性高度暗示了正常組織、腺瘤和癌之間的遺傳譜系相關(guān)性�？寺“l(fā)育分析，確定了細(xì)胞群的動(dòng)態(tài)變化（圖1d），進(jìn)一步證實(shí)了其進(jìn)化關(guān)系。這些質(zhì)量檢查表明，從患者匹配的連續(xù)病變的活檢再現(xiàn)了結(jié)直腸腫瘤發(fā)生的病理進(jìn)展。
 

圖 1

基于聚類、組織來(lái)源和患者來(lái)源的t-SNE圖來(lái)可視化細(xì)胞群（圖2a，b）�；�于幾個(gè)已知細(xì)胞系的典型標(biāo)記基因，確定集群注釋細(xì)胞類型：腸細(xì)胞（GUCA2A）、杯狀（MUC2），腸內(nèi)分泌（CHGA）、腺瘤（腺瘤上皮細(xì)胞）、上皮細(xì)胞（上皮細(xì)胞）、CD8+ T（CD8A）、濾泡輔助T（CXCR5）、中央記憶T（IL7R）、調(diào)節(jié)性T（FOXP3）、自然殺傷T（KLRD1）、濾泡B（MS4A1）、血漿B（MZB1）、M1巨噬細(xì)胞（IL1B）、M2巨噬細(xì)胞（CD163）、單核細(xì)胞（CD14）、成纖維細(xì)胞（COL1A1）、內(nèi)皮細(xì)胞（VWF）和肥大細(xì)胞（KIT）（圖2c和補(bǔ)充圖2a、b）。采用了兩種獨(dú)立的方法來(lái)排除批處理效應(yīng)的影響。我們?cè)趖-SNE圖上觀察到，來(lái)自這三個(gè)患者的腸上皮細(xì)胞和杯狀細(xì)胞分別合并在一起，突出了一種上皮亞型特異性的方式（補(bǔ)充圖3d）。因此，所有這些結(jié)果都保證了scRNA-seq數(shù)據(jù)滿足質(zhì)量的要求，這適合于進(jìn)一步的數(shù)據(jù)挖掘。盡管存在個(gè)體差異，但在所有組織和患者中均觀察到大多數(shù)細(xì)胞群（圖2d和補(bǔ)充圖3g）。來(lái)自不同患者的正常上皮細(xì)胞聚集在一起，這意味著它們具有相似的表達(dá)特征。相比之下，來(lái)自不同患者的異常上皮細(xì)胞（腺瘤或癌）分別聚集在一起，表現(xiàn)出高度異質(zhì)性的特征，表明致癌的分子機(jī)制多樣化（圖2e）。
 

圖 2

2. 結(jié)直癌發(fā)生進(jìn)化過(guò)程中的三個(gè)上皮細(xì)胞階段
為了更好地了解結(jié)直腸癌的發(fā)生，重點(diǎn)研究了正常、腺瘤和癌組織中的上皮細(xì)胞�？紤]到個(gè)體差異，我們分別招募了來(lái)自同一患者的上皮細(xì)胞來(lái)探索上皮細(xì)胞的進(jìn)化。來(lái)自P1和P2的上皮細(xì)胞，如圖2a所示。根據(jù)惡性程度進(jìn)行分類，并使用t-SNE重新繪制分析（圖3a和補(bǔ)充圖6a)。由于上皮細(xì)胞數(shù)量不足，我們將患者3排除在本分析之外（補(bǔ)充圖3g）。正常、腺瘤和癌組織的細(xì)胞明顯分離（圖3b和補(bǔ)充圖6b）。然后，我們根據(jù)上皮細(xì)胞的病理遺傳標(biāo)記物將上皮細(xì)胞分為生理細(xì)胞、良性細(xì)胞、惡性細(xì)胞和其他群體（圖3c和補(bǔ)充圖6c）。非臨床結(jié)直腸上皮標(biāo)記基因，包括腸上皮細(xì)胞（GUCA2A、SLC26A3和CA1）、杯狀細(xì)胞（MUC2和TFF3）、腸內(nèi)分泌細(xì)胞（CHGA）和干細(xì)胞（LGR5）。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，生理細(xì)胞、良性細(xì)胞和惡性細(xì)胞分別主要來(lái)自正常組織、腺瘤組織和癌組織（圖3d和補(bǔ)充圖6d）。將具有代表性的DEGs分為三組（1、2、3），與典型標(biāo)記物一致，對(duì)應(yīng)生理、良性和惡性分期（圖3e）。這些在CRC期間的deg的連續(xù)上調(diào)發(fā)展強(qiáng)調(diào)了一種時(shí)間機(jī)制，驅(qū)動(dòng)從正常到良性到惡性的結(jié)直腸組織。值得注意的是，良性和惡性人群中都包含一組上調(diào)的基因（第2b組：PCCA、LEFTY1、DPEP1、ASCL2、SIVA1、MYC和OLFM4），這意味著良性人群中處于惡性中間階段。這些標(biāo)記基因也為我們提供了一個(gè)研究階段過(guò)渡事件的模型（見(jiàn)圖4）。這些基因在P2上皮細(xì)胞中也觀察到類似的表達(dá)模式（補(bǔ)充圖6e）。然后，通過(guò)將基因表達(dá)數(shù)據(jù)投影到t-SNE圖中（圖3f和補(bǔ)充圖6f），確認(rèn)了它們?cè)诮M織中的分布�；�因集合變異分析（GSVA）解讀了三種細(xì)胞類型的生理和病理信號(hào)（圖3g和補(bǔ)充圖6g）。營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝的特征在正常細(xì)胞群中得到豐富，并與腸上皮細(xì)胞的生理功能相一致。
 

圖 3

對(duì)DEGs的分析將這些混合群體與正常、良性和惡性的上皮細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)（圖3c和補(bǔ)充圖6c）。然后，我們使用富集分析來(lái)描述具有異質(zhì)性組織來(lái)源的細(xì)胞群的轉(zhuǎn)錄組特征。正常腺瘤的混合群體（P1和P2的Cluster9）與生理和良性群體的其余群體相比表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增殖特征（圖4a和補(bǔ)充圖9a）。它們也沒(méi)有干細(xì)胞性特征或基底細(xì)胞特征（圖4b），排除了正常干細(xì)胞的來(lái)源。因此，這兩個(gè)簇可能是正常和腺瘤細(xì)胞之間中間階段的腺瘤前體細(xì)胞群。前體細(xì)胞群位于從生理階段到良性階段的假時(shí)間軌跡路線圖的中間位置（圖4c和補(bǔ)充圖9b）。接下來(lái)，我們確定了特定的標(biāo)記基因來(lái)定義腺瘤前體細(xì)胞群。DEGs分析顯示，這些群體中特異性上調(diào)的基因包括HPGDS、SH2D6、HCK和BMX（圖4d和補(bǔ)充圖9d）。然后，我們通過(guò)檢測(cè)在癌變過(guò)程中起關(guān)鍵作用的標(biāo)記蛋白BMX和SH2D6來(lái)評(píng)估活檢切片中前體群體的復(fù)發(fā)情況（圖4e）。20例患者中有9例和14例分別為腺瘤前體細(xì)胞群中BMX和SH2D6水平較高的細(xì)胞群（補(bǔ)充表3）。出乎意料的是，腺瘤前體細(xì)胞群P1和P2在deg中有約30%的重疊（圖4f）.
 

圖 4 

參考文獻(xiàn)：
[1]Single-cell transcriptomic profiling unravels the adenoma-initiation role of protein tyrosine kinases during colorectal tumorigenesis[J].Signal Transduction and Targeted Therapy[2024-04-29].DOI:10.1038/s41392-022-00881-8.