常見磁珠選擇及其包被過(guò)程的注意事項(xiàng)

根據(jù)官能團(tuán)的不同，磁珠類型自然非常的多樣，羧基磁珠、甲丙酰胺基磁珠、鏈霉親和素磁珠，其中常用的像酶促化學(xué)發(fā)光就用到的羧基磁珠比較多，而像羅氏電化學(xué)發(fā)光用的鏈霉親和素磁珠更多。鏈霉親和素磁珠通常是以三組分的形式，生物素標(biāo)記抗體、磁珠、發(fā)光物標(biāo)記抗體構(gòu)成試劑盒，相比于其他類型反應(yīng)更緩和。磁珠的直徑是非常重要的參數(shù)，磁珠直徑越小能夠結(jié)合的抗體越多，很好地增大抗體結(jié)合的表面積。提高抗原抗體結(jié)合效率。 1、羧基磁珠
表面羧基化大概是最常見的納米材料表面修飾方法了。通過(guò)在磁珠表面修飾羧基，能夠增加磁珠表面的親水性，提高磁珠在水溶液中的穩(wěn)定性，同時(shí)還能夠有效降低磁珠表面的非特異性吸附。羧基表面修飾工藝較為簡(jiǎn)單，而且應(yīng)用廣泛，幾乎每個(gè)磁珠廠家都會(huì)推出羧基表面修飾的磁珠。羧基磁珠表面修飾有豐富的羧基基團(tuán)，能夠在特殊化學(xué)試劑的作用下將蛋白質(zhì)、核酸、多肽等偶聯(lián)到磁珠表面，在蛋白純化、免疫檢測(cè)、分子檢測(cè)、NGS、細(xì)胞分離等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。
在化學(xué)發(fā)光免疫分析中磁珠作為反應(yīng)載體，其上包被特異性抗原或抗體，捕獲待測(cè)物中的靶標(biāo)分子。蛋白質(zhì)可以通過(guò)吸附作用與羧基修飾顆粒結(jié)合，吸附是由蛋白質(zhì)和顆粒表面之間的疏水和離子相互作用介導(dǎo)的，吸附作用發(fā)生非常迅速。除了被吸附外，蛋白質(zhì)還可以共價(jià)連接到羧基修飾的顆粒表面。羧基可以被水溶性碳二亞胺激活，與被吸附蛋白質(zhì)的自由氨基反應(yīng)形成酰胺鍵。此處講到的主要有疏水作用力和共價(jià)連接。在羧基磁珠包被過(guò)程中常用的緩沖體系是Tris體系。
羧基磁珠包被抗體蛋白的方法一般是通過(guò)EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）活化法。EDC是一種水溶性的小分子，無(wú)需有機(jī)溶劑助溶，同時(shí)反應(yīng)過(guò)程中的異脲副產(chǎn)物也是水溶性的，通過(guò)水洗或透析就可以方便的去除。通過(guò)EDC活化后的羧基可以和抗體的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，從而將抗體固定在磁珠表面，這種反應(yīng)通常在偏酸性環(huán)境下完成。
EDC活化羧基偶聯(lián)蛋白的方法有兩種，一種是一步法，先后將抗體、EDC加入至羧基磁珠溶液中，EDC邊活化羧基，同時(shí)與抗體氨基反應(yīng)。這種反應(yīng)簡(jiǎn)單便捷可控，但是EDC過(guò)量容易導(dǎo)致抗體聚集體的發(fā)生，影響活性，并且EDC活化羧基后的活化酯中間體與氨基反應(yīng)的速度較慢，且極易水解，因此反應(yīng)效率往往較低。
另一種是采用兩步法，將EDC活化羧基的反應(yīng)，以及與蛋白氨基形成酰胺鍵的反應(yīng)分為兩個(gè)步驟。這種方法通常需要在第一步活化羧基過(guò)程中引入Sulfo-NHS活化酯。Sulfo-NHS（N-羥基琥珀酰亞胺酯）是一種能夠快速和氨基反應(yīng)的親水小分子。EDC活化羧基后，與Sulfo-NHS形成穩(wěn)定的中間體，去除掉多余的EDC后，再加入抗體蛋白，蛋白上的氨基再與NHS中間體反應(yīng)形成酰胺鍵。采用兩步法能夠有效避免EDC殘留導(dǎo)致抗體蛋白的聚集，同時(shí)Sulfo-NHS的引入能夠有效提高酰胺鍵形成的效率，有的研究表明，引入Sulfo-NHS的兩步偶聯(lián)法，蛋白偶聯(lián)效率是單獨(dú)采用EDC的20倍。此外，Sulfo-NHS的磺酸基能夠在羧基活化后，能夠在微球表面形成負(fù)電荷層，維持微球表面的穩(wěn)定性，防止磁珠聚集。

2、Tosyl甲苯磺酰基磁珠
甲苯磺�；�是化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)當(dāng)中應(yīng)用最為廣泛的一種磁珠表面。甲苯磺�；�不需要活化劑預(yù)先活化，在特定的溶液中就能夠與抗體產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合。反應(yīng)可控性強(qiáng)，非特異性吸附低，包被過(guò)程的重現(xiàn)性好，因此在批量制備磁珠的時(shí)候，批間控制更好。
市場(chǎng)上生產(chǎn)甲苯磺酰基的品牌廠家主要有Dynabeads，以及JSR，Merck也推出了甲苯磺�；�修飾的磁珠。由于甲苯磺�；�的表面修飾工藝更為復(fù)雜，因此鮮有國(guó)內(nèi)磁珠廠家優(yōu)先開發(fā)這類磁珠。
因涂層中含有甲苯磺�；�所以無(wú)需羧合劑，含有氨基的抗體等分子以化學(xué)結(jié)合的方式固定在磁珠表面。隨著化學(xué)結(jié)合的進(jìn)行，甲苯磺酰基會(huì)逐漸脫離，粒子表面親水性增強(qiáng)，從而維持磁珠表面偶聯(lián)物生物活性，并可有效抑制分析時(shí)的非特異性反應(yīng)。
在pH為7.0至8.0的緩沖體系內(nèi)，甲苯磺酰基與蛋白上的巰基反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)緩沖pH調(diào)節(jié)至8.5至9.5時(shí)，與蛋白上的氨基反應(yīng)。
一般偶聯(lián)抗體過(guò)程中，采用100mM的硼酸緩沖液作為偶聯(lián)過(guò)程中的反應(yīng)溶液。先將磁珠用硼酸緩沖液清洗兩到三次，最后用超聲充分將磁珠分散重懸，加入抗體蛋白。通常，甲苯磺酰基的包被過(guò)程中的濃度較羧基的高，一般采用30mg/mL的磁珠濃度進(jìn)行偶聯(lián)包被。磁珠蛋白混勻后，將反應(yīng)管放在設(shè)置好的37°C恒溫?fù)u床中過(guò)夜反應(yīng)（12-18小時(shí)），抗體與甲苯磺�；�即可完成反應(yīng)。如果降低反應(yīng)穩(wěn)定，反應(yīng)時(shí)間則需要進(jìn)一步延長(zhǎng)。此后，即可用含有0.5%BSA，pH7.4的PB緩沖液對(duì)磁珠進(jìn)行封閉。在37°C條件下，只需要封閉1小時(shí)即可，也可在4°C條件下過(guò)夜反應(yīng)。包被過(guò)程結(jié)束后，可以采用工作緩沖液作為磁珠的保存液，通常保存濃度為10mg/mL。

3、鏈霉親和素磁珠
鏈霉親和素是一種四聚體糖蛋白，每一個(gè)亞基可以結(jié)合一個(gè)生物素小分子。二者之間的結(jié)合是已知的最強(qiáng)非共價(jià)結(jié)合之一。一般的，可以采用共價(jià)偶聯(lián)的方式，將鏈霉親和素包被在磁珠表面，再將抗體蛋白生物素化，通過(guò)生物素-鏈霉親和素之間的特異性結(jié)合，將抗體連接至磁珠表面。這種方式免疫檢測(cè)磁珠具有一定通用性，只用一款磁珠，即可完成所有檢測(cè)。羅氏診斷幾乎所有化學(xué)發(fā)光項(xiàng)目都采用生物素-鏈霉親和素的方式完成檢測(cè)。
鏈酶親和素磁性微球可以輕松和生物素化的生物大分子結(jié)合，實(shí)現(xiàn)探針的制備，或者生物大分子的分離。鏈酶親和素磁珠偶聯(lián)C反應(yīng)蛋白(CRP)單克隆抗體并用于免疫層析試紙條。磁珠偶聯(lián)鏈霉親和素能從樣品中對(duì)生物素標(biāo)記的分子進(jìn)行高純度的特異性吸收。因磁珠表面親水性聚合物涂層不會(huì)影響酶促反應(yīng)進(jìn)行，在PCR反應(yīng)體系中混入磁珠也不會(huì)對(duì)核酸擴(kuò)增產(chǎn)生影響。在酶免測(cè)定中，還可作為生物素標(biāo)記抗體的載體進(jìn)行使用。

4、包被經(jīng)驗(yàn)
常用的磁珠包被抗體比例是20μg/mg，磁珠母液濃度是10mg/mL，通常稀釋的工作液是中性緩沖液，1:50稀釋，工作液終濃度0.2mg/mL，磁珠包被過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。此時(shí)就要考慮磁珠與抗體處理工藝，或者抗體本身原料存在問(wèn)題，大部分項(xiàng)目是不會(huì)有聚集，而磁珠包被抗原的項(xiàng)目會(huì)出現(xiàn)聚集項(xiàng)目。此時(shí)就要篩選緩沖體系，或者對(duì)原料進(jìn)行純化處理，像透析等。

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