Julolidinyl aza-BODIPYs 作為 NIR-II 熒光團(tuán)用于納米載體的生物成像

本文要點(diǎn)：聚集引起的猝滅（ACQ）原理已被用于通過排除自由探針衍生的干擾來提高納米載體的熒光成像精度。然而，由于生物組織的吸收和衍射以及組織衍生的自發(fā)熒光，NIR-I （700–900 nm）生物成像的穿透力有限和時(shí)空分辨率低，削弱了其實(shí)用性。本研究旨在開發(fā)基于ACQ的NIR-II（1000–1700 nm）探針，以進(jìn)一步提高成像分辨率和準(zhǔn)確性。所采用的策略是基于較大的取代基效應(yīng)，將高度平面和富含電子的Julolidine安裝到氮雜-BODIPY的3,5位中。新開發(fā)的探針表現(xiàn)出顯著的光物理特性，強(qiáng)吸收集中在大約 850 nm 處，明亮發(fā)射在 950–1300 nm 區(qū)域。與NIR-I對應(yīng)物P2相比，NIR-II探頭表現(xiàn)出優(yōu)異的水敏感性和淬滅穩(wěn)定性。ACQ1 和 ACQ6 在水餾分高于 40% 時(shí)表現(xiàn)出更廣闊的 ACQ 效應(yīng)，在孵育 24 小時(shí)后等離子體中熒光重照低于 2.0% ,具有更高的淬滅穩(wěn)定性。理論計(jì)算驗(yàn)證了分子平面度對ACQ性能的影響大于疏水性。此外，體內(nèi)和體外再照明研究顯示，預(yù)淬滅ACQ1的信號(hào)干擾不到2.5%，而P2的信號(hào)干擾為15%。

 

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圖 1. 3,5-julolidinyl aza-BODIPYs作為NIR-II ACQ探針的設(shè)計(jì)理念

 

研究人員開發(fā)了幾種具有氮雜-二吡咯烯二氟化硼（aza-BODIPY）母體結(jié)構(gòu)的 ACQ 探針，編碼為 P2、FD-B21 和 FD-C7，以探索脂質(zhì)納米顆粒、納米晶體、聚合物納米顆粒和聚合物膠束等各種納米載體的體內(nèi)生物-納米相互作用。這種探針在納米載體的親脂性核心中封裝并充分分散時(shí)會(huì)發(fā)出明亮的熒光。在納米載體降解或拆卸后，探針被釋放到周圍的生理環(huán)境中，迅速聚集，并導(dǎo)致立即和絕對的熒光猝滅，有效地消除了游離探針的干擾，并能夠準(zhǔn)確實(shí)時(shí)跟蹤體內(nèi)的納米載體（圖1 A）在各種類型的熒光探針中，平面和易聚集的氮雜-BODIPY在構(gòu)建NIR-I ACQ探針方面顯示出巨大的潛力。Julolidines 作為 N-雜環(huán)芳香族化合物，具有有限的氮可用性和更強(qiáng)的電子供體能力，是通過 ICT 構(gòu)建熒光染料的有利供體部分。此外，其結(jié)構(gòu)受限和高平坦度可以增加聚集趨勢并改善ACQ性能。將富含電子和高度平面的Julolidine安裝到aza-BODIPYs的3,5位（圖1 B）中，以開發(fā)具有明亮NIR-II熒光的新型ACQ探針。所得的3,5-朱洛烷基ACQ1與1,7-（對甲氧基苯基）在NIR-II區(qū)域顯示出高亮度和出色的ACQ性能，在體外和體內(nèi)淬滅后重新照明最小。
 
在氮雜-BODIPY的3,5位摻入高度平面和富含電子的Julolidines，產(chǎn)生3,5-julolidinyl ACQ1和1,7-（對甲氧基苯基），其發(fā)射落在NIR-II區(qū)域（圖1 C）。在NIR-II區(qū)域明亮熒光的鼓勵(lì)下，通過用固定的3,5-朱洛烷基部分優(yōu)化ACQ1來開發(fā)NIR-II ACQ探針。研究了含有不同空間位阻（ACQ2-4）和電性能（ACQ5-8）的各種1,7-取代基的ACQ1類似物，以微調(diào)分子平面度（圖1 D）。被公認(rèn)為π-π堆疊的驅(qū)動(dòng)力，通過在 ACQ1 的 1,7 個(gè)取代基上安裝疏水（ACQ9-13）和親水（ACQ14）側(cè)鏈，還優(yōu)化了 ACQ 探針的疏水性（圖1 D）。

圖2.  3,5-julolidinyl aza-BODIPYs的光譜和ACQ性質(zhì)

 

烷基側(cè)鏈對吸收和發(fā)射幾乎沒有影響，具有不同鏈的 ACQ1 類似物（ACQ9\u201214）保留了 ACQ1 出色的光物理性質(zhì)，例如以大約 834–896 nm 為中心的強(qiáng)烈吸收（ε = 60,000–68,000 L/（mol·cm））和以大約 880–991 nm （Φ= 3.20%–3.89%）。同時(shí)，熒光成像表明，不僅在NIR-II區(qū)域（1000 LP濾光片）存在明顯的熒光信號(hào)，而且在發(fā)射尾部也有一些通過1300 LP濾光片的熒光，這是NIR-II成像的優(yōu)勢區(qū)域（圖2 C）。其中，ACQ6在這兩種濾光片下表現(xiàn)出最亮的熒光，而ACQ7和ACQ8的熒光強(qiáng)度略弱�？傮w而言，3,5-julolidinyl aza-BODIPYs在NIR-II成像中表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用，在約850 nm處具有強(qiáng)烈的吸收，在NIR-II區(qū)域具有明亮的熒光。

圖3.  3,5-julolidinyl aza-BODIPY標(biāo)記的納米載體的表征和熒光

 

受其高亮度、前景良好的水敏感性和出色的淬滅穩(wěn)定性的啟發(fā)，優(yōu)化的 ACQ1 和 ACQ6 用于標(biāo)記模型納米載體、高動(dòng)態(tài) mPEG2k-PDLLA2k具有核/殼結(jié)構(gòu)的PM和具有基體結(jié)構(gòu)的相對穩(wěn)定的PCL PN，通過以P2為參考的物理嵌入。為了確定探針在PMs和PNs中的負(fù)載能力，選擇ACQ1作為模型探針，并研究了標(biāo)記的PMs和PNs的濃度相關(guān)熒光強(qiáng)度。雖然較高的探針載樣量可能具有較高的熒光強(qiáng)度，但濃度猝滅的效果會(huì)加速。因此，在配方中選擇了目前的兩個(gè)重量分?jǐn)?shù)（0.25%和0.3%），以保證上樣效率和最終熒光強(qiáng)度。由于其他探針具有相同的母體結(jié)構(gòu)、相似的修飾部分，因此具有相似的物理化學(xué)性質(zhì)，因此在標(biāo)記納米載體時(shí)，為其他探針預(yù)設(shè)了相同的負(fù)載水平。理想的ACQ探針應(yīng)在納米載體中分散良好，并發(fā)出明亮的熒光，但在水中應(yīng)完全聚集并完全淬滅（圖3 A）。用ACQ探針標(biāo)記的PM在700-900 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收，在大約950 nm處表現(xiàn)出明亮的發(fā)射，并尾隨到NIR-II窗口，在850-1400 nm范圍內(nèi)具有1.54%-2.01%的量子產(chǎn)率，在1000-1400 nm范圍內(nèi)具有0.21%-0.29%的量子產(chǎn)率，即使在1300 nm以上的波長下也顯示出明顯的信號(hào)，與廣泛而弱的吸收形成鮮明對比，在水中幾乎沒有排放，表明標(biāo)記成功（圖3 B）。同樣，PN也被成功標(biāo)記，并顯示出比標(biāo)記的PM更亮的熒光（圖3 C）。然而，由于PN色散的顯著光散射無法測量吸收，因此無法正確計(jì)算PN的量子產(chǎn)率。PMs與PNs的綜合熒光強(qiáng)度的粗略比較表明，PNs的量子產(chǎn)率高于PMs，與它們的亮度一致，較亮的ACQ6和ACQ4標(biāo)記的納米載流子的熒光高于ACQ1，而較差的ACQ3標(biāo)記的納米載流子的熒光略低。盡管在DMSO中超過1300 nm的區(qū)域中，ACQ6比ACQ1更亮（圖2 A和C），但由于納米載流子內(nèi)的極性較低以及由此產(chǎn)生的光譜藍(lán)移，ACQ6標(biāo)記的納米載流子在PM的該區(qū)域顯示出較弱的熒光。如圖3 D所示，標(biāo)記的PM和PN的流體動(dòng)力學(xué)直徑是單分散的，分別為21和210 nm;它們的 zeta 電位分別低于 ±10 和 ± 3 mV。透射電子顯微鏡（TEM）揭示了標(biāo)記的PM和PN的球形形態(tài)和均勻的尺寸分布（圖3 E）。這些探針被有效地封裝在納米載體中，EE超過90%，而ACQ3的EE為76.0%–81.6%。此外，標(biāo)記的 PM 和 PN 在 24 小時(shí)內(nèi)在 PBS 和等離子體中表現(xiàn)出優(yōu)異的熒光穩(wěn)定性（圖3 F）。此外，NIR-II成像（ACQ1標(biāo)記的PMs）具有較高的空間分辨率，可以清晰地顯示全身血管結(jié)構(gòu)，而NIR-I成像（P2標(biāo)記的PMs）僅顯示熒光區(qū)域的片段，而沒有詳細(xì)信息，證實(shí)了NIR-II成像的優(yōu)越性（圖3 G和H）。

圖4. NIR-II ACQ 探針標(biāo)記的納米載體的體內(nèi)和離體成像

 

為了證明NIR-II ACQ探針在體內(nèi)納米載體實(shí)時(shí)成像方面的優(yōu)越性，通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)后，研究了用 ACQ1 和 ACQ6 標(biāo)記的 PM，以 P2 和劣質(zhì) ACQ3 為對照（圖4 A）。由于較長的波長有利于減少散射和自發(fā)熒光，在1300 nm以上區(qū)域監(jiān)測熒光。同時(shí)，還探索了預(yù)淬滅探針的體內(nèi)復(fù)光。為了評估自由探針的再照明信號(hào)引起的干擾，在兩者都容易積聚的肝臟區(qū)域測量標(biāo)記的PM和預(yù)淬滅探針的熒光，并計(jì)算再照明的比例（圖4 B）。ACQ1、ACQ3 和 ACQ6 標(biāo)記的 PM 在 24 小時(shí)內(nèi)表現(xiàn)出相似的生物分布。PMs主要分布在注射后2 h內(nèi)的血管中。此后，血管信號(hào)逐漸消失，而PMs的肝臟潴留增加，由于單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)的攝取，PMs在8 h達(dá)到峰值。在P2的情況下，觀察到類似的PM生物分布，但只記錄了熒光區(qū)域的片段，沒有透露任何細(xì)節(jié)。與具有高重照明的傳統(tǒng)探頭（DiR）相反，完全沒有觀察到再照明信號(hào)，并且由于其出色的ACQ特性，預(yù)熄滅的NIR-II探針在24小時(shí)內(nèi)估計(jì)的再照明低于6%。在降低最大校準(zhǔn)條后，在24小時(shí)時(shí)僅觀察到ACQ1的微弱青色，熒光復(fù)照率低于2.5%。然而，在給藥后2 h觀察到預(yù)淬滅ACQ3的再照明信號(hào)，隨著時(shí)間的推移而增加，并且在24 h時(shí)高達(dá)相應(yīng)PM組中熒光信號(hào)的5%。盡管預(yù)熄滅的ACQ6顯示出與ACQ1相似的低重照明，但其在PM組中的較低亮度導(dǎo)致重照信號(hào)的干擾相對較高。ACQ6的體內(nèi)ACQ性能較差，與PM標(biāo)記后的低亮度（圖3 B）和PM分解后在極性溶劑中再分散后的熒光略高有關(guān)（圖2 A和C）在1300 nm以上的區(qū)域。預(yù)淬滅 P2 的重新照明在注射后 8 小時(shí)明顯，假信號(hào)不可忽略。假信號(hào)隨時(shí)間增加，在24 h時(shí)高達(dá)PM熒光的14%，這不可避免地干擾了納米載體體內(nèi)命運(yùn)的探索。

為了研究PMs的生物分布和離體游離探針的干擾，在24 h處死小鼠，并解剖和成像各種器官和組織。如圖4C所示，所有標(biāo)記的PMs均表現(xiàn)出相似的生物分布趨勢，主要分布于肝臟、脾臟、肺和腎臟;適度分布于心臟、皮膚和脂肪組織;在大腦和肌肉中的分布有限，與體內(nèi)結(jié)果一致。注射預(yù)淬火的NIR-II探針后，除了肝臟、脾臟和肺外，在器官和組織中幾乎沒有觀察到熒光信號(hào)，這些器官和組織只檢測到微弱的熒光。ACQ1的再照射干擾最小，而ACQ3和ACQ6在肝脾肺的復(fù)照百分比增加，這是由于ACQ3的熒光恢復(fù)率高，ACQ6的PM組熒光強(qiáng)度低。盡管與 P2 相比，脾臟或肺部預(yù)淬滅的 ACQ3/ACQ6 具有相似的再照明，但 NIR-II 探針在肝臟中顯示出較低的再照明百分比，其中更有可能發(fā)生再照明（圖4 D）。與 P2 相比，ACQ1 在所有易重照器官中的再照射百分比顯著降低，表明其作為 ACQ NIR-II 探針的潛在應(yīng)用。此外，體內(nèi)和體外的肝臟復(fù)照比例幾乎相同，表明它們在復(fù)照研究中的一致性（圖4 E）。

 

結(jié)論

為了利用NIR-II成像的高時(shí)空分辨率和深度穿透性，在aza-BODIPY的3,5位（具有更大的取代基效應(yīng)）處安裝了高平面和電子富的julolidine，并構(gòu)建了具有微調(diào)平面性和疏水性的類似物來開發(fā)NIR-II ACQ探針。新開發(fā)的探針在850 nm左右表現(xiàn)出強(qiáng)烈的吸收，摩爾消光系數(shù)為60,000–83,000 L/（mol·cm），在950–1300 nm區(qū)域發(fā)出明亮的熒光，量子產(chǎn)率為1.50%–5.23%，甚至在1300 nm以上的區(qū)域表現(xiàn)出明顯的熒光信號(hào)。與 P2 相比，3,5-julolidinyl 探針在等離子體和 1% 吐溫中的復(fù)照顯著降低。ACQ1 和 ACQ6 在 40% 水下表現(xiàn)出更高的水敏感性和淬滅穩(wěn)定性，孵育 24 小時(shí)后在等離子體中的熒光回收率低于 2.0%。此外，可生物降解 PM 的體內(nèi)生物分布表明，肝臟區(qū)域重新照明的 ACQ1 的偽影最小，值小于 2.5%，與觀察到的 P2 的近 15% 相比顯著降低。離體成像評估也驗(yàn)證了ACQ1的低偽影。

 

參考文獻(xiàn)

Liu C, Cai Y, Zhang Z, et al. Julolidinyl aza-BODIPYs as NIR-II fluorophores for the bioimaging of nanocarriers[J]. Acta Pharmaceutica Sinica B, 2024.

 

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