科學家開發(fā)標記追蹤操控發(fā)育小膠質(zhì)細胞工具小鼠技術詳解

小膠質(zhì)細胞是大腦重要的膠質(zhì)細胞，通常以小膠質(zhì)細胞的穩(wěn)態(tài)基因Tmem119、CX3CR1、P2ry12等構(gòu)建cre工具小鼠研究小膠質(zhì)細胞的功能。近年來，由于單細胞測序技術的快速發(fā)展，鑒定出多種小膠質(zhì)細胞亞群，以疾病相關的小膠質(zhì)細胞（DAMs）、增殖區(qū)相關小膠質(zhì)細胞（PAMs）為典型代表。DAMs主要存在于衰老和神經(jīng)退行性疾病中，而PAMs短暫的出現(xiàn)在發(fā)育期白質(zhì)中。然而，DAMs和PAMs中存在多個共同轉(zhuǎn)錄分子水平變化特征，其中包括C型凝集素受體Clec7a。

2024年5月31日圣路易斯華盛頓大學Qingyun Li團隊在Immunity雜志上發(fā)表文章開發(fā)了研究小膠質(zhì)細胞的工具小鼠-Clec7a-CreER，可標記、追蹤、操控兩種狀態(tài)下的小膠質(zhì)細胞。

1、Clec7a-CreER小鼠可有效標記DAMs和PAMs

研究人員利用CRISPR-Cas9技術構(gòu)建Clec7a-CreER小鼠，并與LSL-tdTomato雜交后流式細胞技術結(jié)果表明出生后第7天Clec7a陽性細胞絕大多數(shù)存在于大腦實質(zhì)中，很少存在于硬腦膜，腦膜，脈絡膜叢。此外，Clec7a陽性細胞也少量存在外周血液中。

Clec7a-CreER小鼠與AD模型小鼠（5xFAD）雜交后Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞分支減少，呈激活狀態(tài)，并且聚集在Aβ斑塊周圍，表現(xiàn)為疾病相關的小膠質(zhì)細胞特性。在另外的脫髓鞘和多發(fā)性硬化癥動物（EAE）模型中Clec7a陽性細胞均能表現(xiàn)出疾病相關的小膠質(zhì)細胞特征。

研究人員進一步對出生后7天的Clec7a-CreER小鼠、5xFAD小鼠和EAE模型小鼠的Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞和Clec7a陰性小膠質(zhì)細胞進行單細胞測序，根據(jù)分子表達特征，將小膠質(zhì)細胞分為10個亞簇，其中亞簇3分子表達與PAMs具有最高的相似性，亞簇6分子表達與DAMs具有最高的相似性。

出生后7天的Clec7a-CreER小鼠亞簇3小膠質(zhì)細胞群與AD模型、EAE模型DAMs存在部分重合的差異性表達基因，其中上調(diào)表達的基因為Clec7a,Lpl,Cd63,Cd9,Apoe,Csf1,Ctsb,Ftl1,Fth1,Aldoa和Mir692-1，下調(diào)表達基因為P2ry12,Tmem119,Selplg和Lgmn。

圖1：Clec7a-CreER小鼠可有效標記DAMs和PAMs

2、Clec7a-CreER小鼠可用于追蹤活化小膠質(zhì)細胞

小膠質(zhì)細胞一旦被激活后命運是如何的？通過急性脫髓鞘模型發(fā)現(xiàn)在5周雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone）處理后小鼠出現(xiàn)顯著的脫髓鞘，并存在大量的激活Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞。在髓鞘再生期這些激活的小膠質(zhì)細胞幾乎不表達Clec7a或其他DAMs標志物。單細胞測序技術結(jié)果表明在脫髓鞘期間小膠質(zhì)細胞富集表達DAMs標志物Lpl,Clec7a和Itgax，在髓鞘再生期這些小膠質(zhì)細胞DAMs標志物下調(diào)，小膠質(zhì)細胞穩(wěn)態(tài)基因Tmem119,P2ry12和Cx3cr1上調(diào)，表明脫髓鞘期形成DAMs在髓鞘再生期會逐漸轉(zhuǎn)變成穩(wěn)態(tài)。

圖2、Clec7a-CreER小鼠可用于追蹤活化小膠質(zhì)細胞

3、Clec7a-CreER小鼠可用于清除活化的小膠質(zhì)細胞

i-DTR小鼠是一種可在白喉毒素介導的細胞清除小鼠，與Clec7a-CreER小鼠雜交后接受白喉毒素處理后可特異性清除Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞。通過該方式，在給予Cuprizone處理的同時特異性清除Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞后能夠減少部分髓鞘的丟失，存在神經(jīng)保護作用。在髓鞘再生期清除Clec7a陽性小膠質(zhì)細胞后阻礙髓鞘的形成。

圖3： Clec7a-CreER小鼠可用于清除活化的小膠質(zhì)細胞

總結(jié)

本文構(gòu)建了Clec7a-CreER工具小鼠，可有效標記發(fā)育期的PAMs和疾病中的DAMs，也可在疾病期間動態(tài)追蹤激活小膠質(zhì)細胞的命運轉(zhuǎn)化，可特異性清除DAMs研究其功能作用。

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