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NSUN2介導(dǎo)m5C甲基化增強(qiáng)HGH1 mRNA穩(wěn)定性以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的研究

瀏覽次數(shù)：455　發(fā)布日期：2024-6-18　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

RNA m5C甲基化已被證明廣泛參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。作為主要的m5C甲基轉(zhuǎn)移酶，NSUN2在多種腫瘤類(lèi)型中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。但NSUN2介導(dǎo)的m5C修飾對(duì)乳腺癌（BC）的具體作用仍不清楚。

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院/河南省精準(zhǔn)臨床藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室闞全程、田鑫團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院大學(xué)楊運(yùn)桂合作闡明NSUN2如何通過(guò)m5C修飾調(diào)控靶基因HGH1，從而促進(jìn)乳腺癌發(fā)展的分子機(jī)制，以及初步明確NSUN2和HGH1在乳腺癌中的生物學(xué)作用。相關(guān)研究成果于2024年6月6日以“NSUN2/YBX1 promotes the progression of breast cancer by enhancing HGH1 mRNA stability through m5C methylation”為題發(fā)表在《Breast Cancer Research》（乳腺癌研究）期刊。

標(biāo)題：NSUN2/YBX1 promotes the progression of breast cancer by enhancing HGH1 mRNA stability through m5C methylation（NSUN2/YBX1通過(guò)m5C甲基化增強(qiáng)HGH1 mRNA穩(wěn)定性，從而促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展）
時(shí)間：2024.6.6
期刊：《Breast Cancer Research》（乳腺癌研究）（中科院1區(qū)，影響因子7.4）
實(shí)驗(yàn)方法：RNA BS-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR、蛋白組學(xué)、co-IP、Ribo-seq等

本研究收集了5位乳腺癌（BC）患者的腫瘤和鄰近組織樣本。通過(guò)RNA測(cè)序(RNA-seq)和單堿基分辨率的m5C甲基化測(cè)序(RNA-BisSeq)篩選了BC中的m5C修飾靶標(biāo)HGH1。并利用甲基化RNA免疫沉淀-qPCR(MeRIP-qPCR)和RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀-qPCR(RIP-qPCR)鑒定了甲基化分子NSUN2和YBX1通過(guò)m5C修飾特異識(shí)別并結(jié)合HGH1。此外，研究還使用蛋白組學(xué)、共免疫沉淀(co-IP)和核糖體測(cè)序(Ribo-Seq)探索了HGH1在BC中的生物學(xué)作用。

研究結(jié)果表明，作為主要的m5C甲基化酶，NSUN2在BC中異常高表達(dá)，并提高了RNA m5C的整體水平。而敲低NSUN2表達(dá)可以在體外和體內(nèi)抑制BC進(jìn)展。結(jié)合RNA-seq和RNA-BisSeq分析鑒定出HGH1作為異常m5C修飾的潛在靶標(biāo)。研究闡明了NSUN2如何通過(guò)m5C修飾調(diào)控HGH1表達(dá)的機(jī)制，這一過(guò)程包括與YBX1蛋白互作，共同影響mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)合成。本研究首次揭示了HGH1與翻譯延伸因子EEF2結(jié)合，為理解其在調(diào)節(jié)BC細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率和蛋白質(zhì)合成能力方面提供了全面認(rèn)識(shí)。

總之，本研究初步闡明了從轉(zhuǎn)錄后修飾到蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中NSUN2-YBX1-m5C-HGH1軸的調(diào)控作用，揭示了異常RNA m5C修飾在BC中的關(guān)鍵角色，并表明HGH1可能是一個(gè)新的表觀(guān)遺傳生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

本研究機(jī)理圖

結(jié)果圖形
（1）NSUN2高表達(dá)與乳腺癌和較差的預(yù)后顯著相關(guān)

圖1：乳腺癌樣本中NSUN2高表達(dá)。

（A）TCGA數(shù)據(jù)集中正常組織和BC組織中的NSUN2表達(dá)。
（B） TCGA數(shù)據(jù)集中NSUN2表達(dá)高或低的BC患者的總生存概率圖。
（C）通過(guò)RNA-Seq（n=5）評(píng)估的5個(gè)臨床BC組織和鄰近組織樣本中的NSUN2 mRNA表達(dá)。
（D） NSUN2在5個(gè)BC石蠟組織樣品中的表達(dá)。
（E） 5個(gè)BC和相鄰組織樣品（n=5）中NSUN2 蛋白表達(dá)的LC-MS/TOF分析。
（F） 5種乳腺細(xì)胞系中 NSUN2 表達(dá)的Western blot分析。
（G）將BALB/c小鼠（每組n=5）的乳腺脂肪墊手術(shù)注射到含有MCF7細(xì)胞的乳腺脂肪墊中，稱(chēng)量腫瘤、測(cè)量腫瘤體積。
（H） IHC染色后不同組 CDX 腫瘤中 NSUN2 和 Ki-67 表達(dá)的代表性圖像。

（2）NSUN2通過(guò)m5C甲基轉(zhuǎn)移酶活性促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展

圖2：NSUN2通過(guò)甲基轉(zhuǎn)移酶活性促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。

(A) 和 (B) 通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)分析敲低NSUN2（NSUN2-knockdown）、野生型NSUN2（NSUN2-WT）或雙催化突變型NSUN2（NSUN2-DM）的乳腺癌細(xì)胞增殖。
(C) 和 (D) 通過(guò)集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估上述三種細(xì)胞類(lèi)型的集落形成能力。
(E) 和 (F) 使用Transwell實(shí)驗(yàn)分析敲低NSUN2、NSUN2-WT或NSUN2-DM細(xì)胞遷移和侵襲能力。
(G) 使用FITC和PE熒光染料通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)NSUN2敲低后的細(xì)胞凋亡變化。

（3）RNA-Seq聯(lián)合RNA-Bisseq篩選確定HGH1為乳腺癌m5C調(diào)控的潛在靶基因
由于NSUN2是負(fù)責(zé)RNA m5C修飾的主要甲基轉(zhuǎn)移酶，研究人員分析了NSUN2促進(jìn)乳腺癌(BC)進(jìn)展機(jī)制：從5名臨床患者中選擇癌癥和鄰近組織樣本，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-seq）和mRNA m5C亞硫酸鹽測(cè)序（RNA-BS）。

研究首先證實(shí)了NSUN2可以影響mRNA中m5C的整體甲基化水平（圖3A）。結(jié)合RNA-seq和RNA-BS測(cè)序篩選了BC組織中m5C修飾的mRNA靶標(biāo)。

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了與鄰近組織相比，BC組織中有297個(gè)高甲基化位點(diǎn)和268個(gè)低甲基化位點(diǎn)（圖3B）。

對(duì)mRNA的不同區(qū)域中m5C修飾的比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明5'-UTR區(qū)域的m5C位點(diǎn)在腫瘤組織和鄰近組織中覆蓋相似。值得注意的是，3'-UTR區(qū)域在腫瘤組織中的m5C位點(diǎn)更多（圖3C）。

KEGG分析揭示了多個(gè)與BC相關(guān)和腫瘤相關(guān)的通路，包括內(nèi)分泌抵抗、雌激素信號(hào)、PI3K-Akt和Ras信號(hào)通路，在m5C修飾中富集（圖3D）。

甲基化和轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)聯(lián)合分析結(jié)果表明，在BC組織中，有18個(gè)位點(diǎn)呈現(xiàn)高甲基化和高表達(dá)，25個(gè)位點(diǎn)高甲基化和低表達(dá)，16個(gè)位點(diǎn)低甲基化和高表達(dá)，以及38個(gè)位點(diǎn)低甲基化和低表達(dá)（圖3E）。研究人員推測(cè)BC中高甲基化和高表達(dá)的基因可能具有較強(qiáng)的致癌作用。

聚類(lèi)分析熱圖揭示了18個(gè)在BC中高甲基化和高表達(dá)的基因（圖3F）。其中HGH1和RP5-1180C10.2在80%的腫瘤組織中表現(xiàn)出高甲基化水平，而在80%的鄰近組織中表現(xiàn)出低甲基化水平。

由于RP5-1180C10.2是一種已知的lncRNA，研究人員選擇HGH1作為18個(gè)基因中的重要候選基因。對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的分析也顯示HGH1在乳腺腫瘤組織中高表達(dá)（圖3G）。

此外，高HGH1表達(dá)的患者相比低HGH1表達(dá)的患者生存率相對(duì)較差（圖3H）。

研究人員還收集了臨床患者樣本以驗(yàn)證HGH1在BC組織中的RNA和蛋白水平上都比鄰近組織更高表達(dá)（圖3I和J）。

圖3：篩選異常m5C高甲基化基因

(A) MCF7和T47D細(xì)胞的mRNA m5C dot blot實(shí)驗(yàn)，無(wú)論是否敲低NSUN2。
(B) 火山圖顯示腫瘤與鄰近組織間差異表達(dá)的m5C位點(diǎn)（n=5）。
(C) BC組織與鄰近組織間mRNA區(qū)域m5C修飾的不同比例。
(D) KEGG分析顯示，在BC組織中表達(dá)水平高的m5C高甲基化基因在致癌信號(hào)通路中富集。
(E) BC組織的RNA-Seq和RNA-BS的靶基因重疊分析（n=5）。
(F) 聚類(lèi)分析熱圖顯示不同組織樣本的表達(dá)水平。
(G) 數(shù)據(jù)庫(kù)分析揭示腫瘤組織中HGH1表達(dá)增加。
(H) 生存分析顯示，HGH1高表達(dá)組的預(yù)后較差。
(I-J) RT-qPCR和IHC實(shí)驗(yàn)證明HGH1在BC組織中表達(dá)水平高于配對(duì)的鄰近組織。

（4）抑制HGH1延緩乳腺癌進(jìn)展

圖4：抑制HGH1可以延緩乳腺癌進(jìn)展

(A) CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)siHGH1（HGH1的siRNA）或oeHGH1（HGH1過(guò)表達(dá)載體）干擾后BC細(xì)胞增殖率。
(B) 檢測(cè)shHGH1（HGH1的shRNA）或oeHGH1干擾后BC細(xì)胞的集落形成能力。
(C) 評(píng)估HGH1敲低后BC細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
(D) 使用FITC和PE熒光染料通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HGH1敲低后細(xì)胞凋亡變化。
(E) 使用PI熒光染料在HGH1敲低或過(guò)表達(dá)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化。
(F) 將MCF7細(xì)胞注射到BALB/c小鼠乳腺脂肪墊中（每組n=5），測(cè)量腫瘤重量和體積。
(G) 不同組CDX腫瘤中HGH1和Ki-67表達(dá)的代表性圖像。

（5）HGH1是BC細(xì)胞翻譯效率的積極因子

圖5：HGH1影響B(tài)C細(xì)胞的翻譯效率

（A） STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析顯示EEF2和HGH1之間的蛋白質(zhì)互作關(guān)系。
（B-C） LC-MS/TOF數(shù)據(jù)的火山圖和直方圖，顯示EEF2和HGH1在BC組織中的高表達(dá)。
（D-E）用1µM嘌呤霉素處理用siEEF2（D）或siHGH1（E）轉(zhuǎn)染的MCF7和T47D細(xì)胞1小時(shí)，并用抗嘌呤霉素抗體對(duì)全細(xì)胞裂解物進(jìn)行western blot分析。
（F）使用過(guò)量蛋白質(zhì)和抗HGH1-蛋白A/G磁性珠復(fù)合物從MCF7細(xì)胞中捕獲EEF2。洗脫后的材料通過(guò)western blot和免疫印跡分析，使用抗EEF2、抗HGH1和抗GAPDH抗體進(jìn)行檢測(cè)，以確認(rèn)HGH1和EEF2的互作。
（G）通過(guò)Ribo Seq分析MCF7細(xì)胞的平均翻譯效率（TE）。

（6）HGH1受NSUN2調(diào)控并依賴(lài)于其m5C甲基轉(zhuǎn)移酶活性

圖6：NSUN2介導(dǎo)的mRNA m5C甲基化促進(jìn)HGH1表達(dá)

（A）RT-qPCR檢測(cè)NSUN2敲低后BC細(xì)胞系中HGH1表達(dá)，
（B）使用western blot進(jìn)一步分析確認(rèn)蛋白質(zhì)水平變化。
（C-D） RT-qPCR和Western blot分析用于評(píng)估NSUN2-WT或NSUN2-DM過(guò)表達(dá)后HGH1表達(dá)的變化。
（E）MeRIP-qPCR分析BC細(xì)胞中NSUN2敲除后HGH1 mRNA上的m5C水平。
（F）NSUN2敲低后檢測(cè)到對(duì)放線(xiàn)菌素D介導(dǎo)的RNA合成抑制和mRNA轉(zhuǎn)錄干擾的響應(yīng)變化。
（G-H） CCK-8實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NSUN2和HGH1對(duì)BC細(xì)胞增殖的影響及其下游關(guān)系。
（I）集落形成實(shí)驗(yàn)分析在NSUN2敲低細(xì)胞系中恢復(fù)下游基因HGH1表達(dá)對(duì)BC細(xì)胞擴(kuò)增能力的影響。

（7）NSUN2和YBX1通過(guò)影響mRNA穩(wěn)定性和翻譯來(lái)調(diào)控HGH1表達(dá)

圖7：YBX1是調(diào)控乳腺癌中HGH1表達(dá)的重要m5C分子

(A) 使用YBX1抗體進(jìn)行RIP-qPCR分析NSUN2-WT存在時(shí)YBX1與HGH1 mRNA的結(jié)合水平。
(B) 在NSUN2敲低后，檢測(cè)對(duì)放線(xiàn)菌素D介導(dǎo)的RNA合成抑制和mRNA轉(zhuǎn)錄干擾的響應(yīng)變化。
(C) 在MCF7和T47D細(xì)胞系中敲低siYBX1后，使用RT-qPCR檢測(cè)目標(biāo)基因HGH1表達(dá)水平變化。
(D) 在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)YBX1野生型(WT)和突變型(Mut)，檢測(cè)HGH1表達(dá)的變化。
(E-F) 通過(guò)Western blot分析敲低或過(guò)表達(dá)YBX1后蛋白水平的變化。
(G-H) 通過(guò)RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NSUN2和YBX1對(duì)HGH1表達(dá)的協(xié)同效應(yīng)。

本研究創(chuàng)新點(diǎn)
本研究的關(guān)鍵創(chuàng)新和發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)方面：
（1）NSUN2的甲基轉(zhuǎn)移酶活性對(duì)其促進(jìn)乳腺癌(BC)進(jìn)展的作用：
驗(yàn)證了NSUN2通過(guò)其m5C甲基化酶活性部分依賴(lài)性地促進(jìn)乳腺癌進(jìn)展。
通過(guò)收集患者的乳腺癌組織，并結(jié)合RNA-Seq和RNA-BS數(shù)據(jù)，篩選了m5C修飾位點(diǎn)，并在單堿基分辨率水平上鑒定出關(guān)鍵靶標(biāo)HGH1。
（2）NSUN2/YBX1依賴(lài)于m5C調(diào)控HGH1 mRNA穩(wěn)定性和表達(dá)的分子機(jī)制：
通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)闡明了NSUN2/YBX1依賴(lài)于m5C來(lái)調(diào)控HGH1 mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)的分子機(jī)制。
不僅驗(yàn)證了HGH1對(duì)乳腺癌進(jìn)展的促進(jìn)作用，還通過(guò)co-IP和Ribo-Seq初步闡明HGH1在人類(lèi)乳腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能。

未來(lái)研究方向

需要進(jìn)一步研究NSUN2和m5C修飾靶標(biāo)是否可以作為乳腺癌亞型的生物標(biāo)志物。
計(jì)劃進(jìn)行更深入的分子結(jié)構(gòu)層面研究，探索從轉(zhuǎn)錄后修飾到蛋白翻譯過(guò)程中的潛在機(jī)制。
擴(kuò)大臨床患者樣本數(shù)量，收集包括新鮮腫瘤組織、血液和尿液在內(nèi)的樣本，進(jìn)行多角度聯(lián)合分析，以驗(yàn)證RNA m5C修飾是否可以作為腫瘤的診斷標(biāo)記和表觀(guān)遺傳治療靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：
Zhang X, An K, Ge X, Sun Y, Wei J, Ren W, Wang H, Wang Y, Du Y, He L, Li O, Zhou S, Shi Y, Ren T, Yang YG, Kan Q, Tian X. NSUN2/YBX1 promotes the progression of breast cancer by enhancing HGH1 mRNA stability through m5C methylation. Breast Cancer Res. 2024 Jun 6;26(1):94. pii: 10.1186/s13058-024-01847-0. doi: 10.1186/s13058-024-01847-0. PubMed PMID: 38844963.

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