微量DNA甲基化分析揭示MeCP2在卵子發(fā)生和卵巢衰老中的表觀遺傳調(diào)控
DNA甲基化在卵子發(fā)生過程中逐漸獲得，這一過程由成功的卵泡發(fā)育維持，對成功卵泡發(fā)育至關(guān)重要。異常的早期卵泡發(fā)育會導(dǎo)致卵巢老化、早發(fā)性卵巢功能衰竭（POF）和女性不孕。然而，作為一種與甲基化DNA特異性結(jié)合的表觀遺傳調(diào)控因子，甲基胞嘧啶結(jié)合蛋白2（MeCP2）在卵子發(fā)生中的功能仍然未知。
2024年4月5日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院副研究員張銀麗博士和張松英教授共同通訊在《Cellular and Molecular Life Sciences》雜志發(fā)表題為“CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes”的科學(xué)研究論文。本研究通過微量甲基化測序和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序分析等揭示了MeCP2在卵巢中的功能和蛋白質(zhì)降解機(jī)制，表明CRL4DCAF13 E3連接酶靶向MeCP2降解，從而防止DNA高甲基化并保持正常轉(zhuǎn)錄的新機(jī)制，并預(yù)示DCAF13-MeCP2軸異常參與卵巢衰老。
標(biāo)題：CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes（CRL4DCAF13 E3泛素連接酶靶向MeCP2降解，以防止DNA高甲基化，并確保生長中的卵母細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄。）
時間：2024.04.05
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences
影響因子：IF 8 / 1區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：Western Blot、轉(zhuǎn)錄組分析、微量WGBS等
研究摘要：
本研究通過對野生型ICR小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的一系列比較分析結(jié)果表明，MeCP2蛋白在原始卵泡和初級卵泡中高表達(dá)，但在次級卵泡中幾乎檢測不到。但在衰老卵巢中，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的MeCP2蛋白顯著增加。生長中的卵母細(xì)胞中的MeCP2過表達(dá)會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失調(diào)、DNA高甲基化和基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致卵泡生長停滯和凋亡。DCAF13是Cullin 4-RING（CRL4）E3連接酶的底物識別接頭，可以靶向MeCP2，并在細(xì)胞和卵母細(xì)胞中被多泛素化以進(jìn)行降解。Dcaf13基因敲除的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出MeCP2蛋白積累，并且在MeCP2敲低后部分挽救了由Dcaf13缺失誘導(dǎo)的卵泡生長停滯。RNA-seq結(jié)果揭示生長中的卵母細(xì)胞中，大量基因受DCAF13-MeCP2軸調(diào)控。本研究表明，CRL4DCAF13 E3泛素連接酶靶向MeCP2進(jìn)行降解，以確保生長中的卵母細(xì)胞中正常的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄。此外，在衰老的卵泡中，觀察到DCAF13和DDB1蛋白的死亡，表明了一種潛在調(diào)控卵巢衰老的新機(jī)制。
DCAF13-MeCP2軸參與卵泡生長示意圖
在次級卵泡中，MeCP2在年輕卵母細(xì)胞中被CRL4DCAF13 E3連接酶多泛素化并降解。這一過程促進(jìn)了與翻譯和ATP合成相關(guān)的基因表達(dá)，同時抑制了與染色質(zhì)修飾相關(guān)的基因表達(dá)。因此確保了從次級卵泡到竇卵泡的成功發(fā)育。在衰老的卵母細(xì)胞中，DDB1和DCAF13水平的降低穩(wěn)定了MeCP2，導(dǎo)致CpG島中的DNA高甲基化、轉(zhuǎn)錄失調(diào)和卵泡生長停滯。
實(shí)驗(yàn)方法：
通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除特定基因，對野生型ICR小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)操作和分析。以研究其對卵子生長和卵泡發(fā)育的影響。
使用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括免疫熒光分析、Western Blot、qRT-PCR、RNA-seq、微量全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）等。
研究結(jié)果：
（1）MeCP2蛋白在原始卵泡和初級卵泡中高表達(dá)，并在衰老的卵巢中積累
圖1：MeCP2蛋白在原始卵泡和初級卵泡的卵母細(xì)胞中高表達(dá)，并且隨著年齡的增長而表達(dá)量增加。
A. 抗MeCP2抗體（ab2828）染色的Ddx4-Rfp小鼠不同階段卵泡的代表性圖像。Pm表示原始卵泡，Pr表示初級卵泡，Sec表示次級卵泡，Ant表示竇卵泡。
B. (A)中所指階段卵泡中卵母細(xì)胞MeCP2熒光強(qiáng)度的定量。
C. 5日齡和21日齡產(chǎn)后小鼠卵巢中MeCP2表達(dá)的Western Blot分析。
D. 使用抗MeCP2抗體，對2月齡和11月齡的野生型小鼠的卵泡進(jìn)行Western Blot分析。
E. 使用抗MeCP2抗體對2月齡和11月齡的Ddx4-Rfp小鼠卵巢進(jìn)行免疫熒光染色。
F. (E)中卵母細(xì)胞MeCP2熒光強(qiáng)度的定量。
（2）MeCP2 過表達(dá)損害卵泡生長和存活
圖2：MeCP2在生長中的卵母細(xì)胞中過表達(dá)抑制卵泡生長。
A. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。Flag或Flag-MeCP2 cRNAs顯微注射到次級卵泡的卵母細(xì)胞中，結(jié)合或不結(jié)合mCherry cRNAs，然后培養(yǎng)1-6天。在第1、3和6天進(jìn)行卵泡直徑測量和死亡率統(tǒng)計(jì)。同時，在第1和第3天收集免疫熒光樣本。第6天收集卵泡培養(yǎng)基進(jìn)行激素測定。
B. 免疫染色顯示MeCP2過表達(dá)對次級卵泡生長中的卵母細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)（DAPI）的影響。
C. (B)中紅虛線指示的DAPI染色信號定量。
D. 在Flag或Flag-Mecp2 cRNAs過表達(dá)后第1、3和6天卵泡發(fā)育的代表性的明場顯微照片。
E. 對照組（n=32）或MeCP2過表達(dá)組（n=33）中，第1、3和6天的卵泡直徑定量。
F. 對照組或MeCP2度表達(dá)組（n=72-76）中，第1、3和6天的卵泡死亡率定量。
G,H. Ki67（G）和PCNA（H）在對照組和MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中的免疫熒光結(jié)果。
I. Western blotting結(jié)果顯示對照組和MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中的Ki67、Cleaved-PARP和FLAG表達(dá)。
J. MeCP2過表達(dá)卵泡卵母細(xì)胞中的γH2AX免疫熒光結(jié)果。
K. 在Flag或Flag-Mecp2（白色箭頭）cRNAs過表達(dá)后，同一圖像中生長中的卵母細(xì)胞的TUNEL免疫熒光結(jié)果。
L. 第6天卵泡培養(yǎng)基中雌二醇測量。
（3）MeCP2過表達(dá)誘導(dǎo)生長期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)
B. (A)中卵母細(xì)胞pPSII熒光強(qiáng)度定量。
C. 出生后第1天、5天和10天小鼠卵巢中pPSII的Western Blot分析。
D. 在Flag或Flag-Mecp2 mRNAs過表達(dá)1天后，用抗pPSII和5-乙炔基尿嘧啶（EU）對卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，以指示卵母細(xì)胞中的RNA轉(zhuǎn)錄活性。
E. (D)中pPSII和EU熒光信號強(qiáng)度定量。
F. Flag或Flag-Mecp2 mRNAs過表達(dá)后生長中的卵母細(xì)胞中pPSII蛋白水平的Western Blot結(jié)果
G. 散點(diǎn)圖顯示對照組（Ctrl）和MeCP2過表達(dá)（MeCP2 OE）卵母細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄變化。基因表達(dá)增加或減少超過兩倍分別用紅色和藍(lán)色表示。
H,I. MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中上調(diào)（H）和下調(diào)（I）的GO分析生物學(xué)過程富集。
J. MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中指示信號通路的GSEA富集圖和關(guān)鍵組分基因的箱線圖。
（4）MeCP2過表達(dá)誘導(dǎo)生長期卵母細(xì)胞DNA高甲基化
B. 對照組和MeCP2過表達(dá)組卵母細(xì)胞樣本中mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
C. 密度圖顯示MeCP2過表達(dá)生長中的卵母細(xì)胞二價CpG島周圍的平均DNA甲基化增加。
D. 對照組和MeCP2過表達(dá)組生長中的卵母細(xì)胞內(nèi)基因體和2kb側(cè)翼（上游和下游）區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
E. 對照組和MeCP2過表達(dá)組生長中的卵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座元件（TE）和2kb側(cè)翼區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
F. MeCP2過表達(dá)后上調(diào)和下調(diào)基因的基因體和啟動子區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
G. 維恩圖顯示差異表達(dá)基因（DEGs）與差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因（DMGs）的交集。
H. （G）中交集基因的GO注釋的生物學(xué)過程。
I. 基因組瀏覽器綜合視圖顯示MeCP2過表達(dá)后甲基化水平增加和mRNA下調(diào)的Cldn34d基因。
（5）CRL4DCAF13靶向MeCP2在HeLa細(xì)胞中的泛素化和降解
B. 經(jīng)FLAG-GFP、FLAG-DCAF13、FLAG-DDB1和FLAG-CUL4A轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞MeCP2內(nèi)部和FLAG的免疫熒光結(jié)果。
C. 靶向陰性對照（siNC）、Dcaf13（siDcaf13）和Ddb1（siDdb1）的siRNAs轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞指定蛋白的Western Blot分析。
D. 經(jīng)對照、FLAG-DCAF13和FLAG-DDB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，分別在0、6、12和24小時CHX處理的MeCP2、DDB1和DCAF13表達(dá)的Western Blot分析結(jié)果。
E. MeCP2與DCAF13、DDB1和CUL4A在Hela細(xì)胞中互作的免疫沉淀和Western Blot結(jié)果。
F. 免疫沉淀后進(jìn)行Western Blot分析，顯示對照Hela細(xì)胞以及指定蛋白編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MeCP2多泛素化。
（6）卵母細(xì)胞Dcaf13缺失導(dǎo)致MeCP2蛋白積累并抑制卵泡生長
圖6：Dcaf13基因敲除導(dǎo)致生長中的卵母細(xì)胞中MeCP2的積累和轉(zhuǎn)錄失調(diào)。
A. 21日齡的野生型（Dcaf13f/f）和Dcaf13條件性敲除（cKO, Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）小鼠卵巢的DCAF13免疫組化代表性圖像。
B. 21日齡的野生型（Dcaf13f/f）和Dcaf13 cKO（Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）小鼠卵巢的H&E染色代表性圖像。
C. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠卵母細(xì)胞中MeCP2、pPSII和DCAF13蛋白水平的Western Blot結(jié)果。
D. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次級卵泡中MeCP2表達(dá)的免疫熒光。
E. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的卵泡卵母細(xì)胞核中pPSII表達(dá)的免疫熒光結(jié)果。
F. (E)中pPSII熒光信號強(qiáng)度定量。
G. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次級卵泡中，分別在siNC或siMecp2微注射后第1、3和6天的卵泡發(fā)育的明場圖像（每組n=2只小鼠）。
H. (G)中指定組的卵泡直徑定量。
I. 2月齡和11月齡小鼠卵母細(xì)胞中pPSII、DDB1和DCAF13表達(dá)的Western Blot結(jié)果。
（7）與染色質(zhì)共價修飾相關(guān)的DCAF13-MeCP2軸異常抑制翻譯和激活基因表達(dá)
B. 上方的維恩圖顯示Dcaf13 cKO上調(diào)基因與MeCP2過表達(dá)上調(diào)基因的重疊，而下方維恩圖顯示Dcaf13 cKO下調(diào)基因與MeCP2過表達(dá)下調(diào)基因的重疊。
C. 熱圖顯示Dcaf13 cKO或MeCP2過表達(dá)相對于各自對照后生長中的卵母細(xì)胞中下調(diào)和上調(diào)基因。
D. 通過基因本體（GO）分析獲得的MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中下調(diào)和上調(diào)的生物學(xué)過程富集，在Dcaf13 cKO卵母細(xì)胞中重疊。
E,F. 熱圖顯示MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中上調(diào)（E）和下調(diào)（F）基因的表達(dá)動態(tài)，這些基因在Dcaf13 cKO卵母細(xì)胞中重疊。
參考文獻(xiàn)：
Ren P, Tong X, Li J, Jiang H, Liu S, Li X, Lai M, Yang W, Rong Y, Zhang Y, Jin J, Ma Y, Pan W, Fan HY, Zhang S, Zhang YL. CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes. Cell Mol Life Sci. 2024 Apr 5;81(1):165. pii: 10.1007/s00018-024-05185-4. doi: 10.1007/s00018-024-05185-4. PubMed PMID: 38578457.
2024年4月5日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院副研究員張銀麗博士和張松英教授共同通訊在《Cellular and Molecular Life Sciences》雜志發(fā)表題為“CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes”的科學(xué)研究論文。本研究通過微量甲基化測序和對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序分析等揭示了MeCP2在卵巢中的功能和蛋白質(zhì)降解機(jī)制，表明CRL4DCAF13 E3連接酶靶向MeCP2降解，從而防止DNA高甲基化并保持正常轉(zhuǎn)錄的新機(jī)制，并預(yù)示DCAF13-MeCP2軸異常參與卵巢衰老。
標(biāo)題：CRL4DCAF13 E3 ubiquitin ligase targets MeCP2 for degradation to prevent DNA hypermethylation and ensure normal transcription in growing oocytes（CRL4DCAF13 E3泛素連接酶靶向MeCP2降解，以防止DNA高甲基化，并確保生長中的卵母細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄。）
時間：2024.04.05
期刊：Cellular and Molecular Life Sciences
影響因子：IF 8 / 1區(qū)
實(shí)驗(yàn)方法：Western Blot、轉(zhuǎn)錄組分析、微量WGBS等
研究摘要：
本研究通過對野生型ICR小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的一系列比較分析結(jié)果表明，MeCP2蛋白在原始卵泡和初級卵泡中高表達(dá)，但在次級卵泡中幾乎檢測不到。但在衰老卵巢中，卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的MeCP2蛋白顯著增加。生長中的卵母細(xì)胞中的MeCP2過表達(dá)會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失調(diào)、DNA高甲基化和基因組不穩(wěn)定，最終導(dǎo)致卵泡生長停滯和凋亡。DCAF13是Cullin 4-RING（CRL4）E3連接酶的底物識別接頭，可以靶向MeCP2，并在細(xì)胞和卵母細(xì)胞中被多泛素化以進(jìn)行降解。Dcaf13基因敲除的卵母細(xì)胞表現(xiàn)出MeCP2蛋白積累，并且在MeCP2敲低后部分挽救了由Dcaf13缺失誘導(dǎo)的卵泡生長停滯。RNA-seq結(jié)果揭示生長中的卵母細(xì)胞中，大量基因受DCAF13-MeCP2軸調(diào)控。本研究表明，CRL4DCAF13 E3泛素連接酶靶向MeCP2進(jìn)行降解，以確保生長中的卵母細(xì)胞中正常的DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄。此外，在衰老的卵泡中，觀察到DCAF13和DDB1蛋白的死亡，表明了一種潛在調(diào)控卵巢衰老的新機(jī)制。
DCAF13-MeCP2軸參與卵泡生長示意圖
在次級卵泡中，MeCP2在年輕卵母細(xì)胞中被CRL4DCAF13 E3連接酶多泛素化并降解。這一過程促進(jìn)了與翻譯和ATP合成相關(guān)的基因表達(dá)，同時抑制了與染色質(zhì)修飾相關(guān)的基因表達(dá)。因此確保了從次級卵泡到竇卵泡的成功發(fā)育。在衰老的卵母細(xì)胞中，DDB1和DCAF13水平的降低穩(wěn)定了MeCP2，導(dǎo)致CpG島中的DNA高甲基化、轉(zhuǎn)錄失調(diào)和卵泡生長停滯。
實(shí)驗(yàn)方法：
通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除特定基因，對野生型ICR小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)操作和分析。以研究其對卵子生長和卵泡發(fā)育的影響。
使用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，包括免疫熒光分析、Western Blot、qRT-PCR、RNA-seq、微量全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）等。
研究結(jié)果：
（1）MeCP2蛋白在原始卵泡和初級卵泡中高表達(dá)，并在衰老的卵巢中積累
A. 抗MeCP2抗體（ab2828）染色的Ddx4-Rfp小鼠不同階段卵泡的代表性圖像。Pm表示原始卵泡，Pr表示初級卵泡，Sec表示次級卵泡，Ant表示竇卵泡。
B. (A)中所指階段卵泡中卵母細(xì)胞MeCP2熒光強(qiáng)度的定量。
C. 5日齡和21日齡產(chǎn)后小鼠卵巢中MeCP2表達(dá)的Western Blot分析。
D. 使用抗MeCP2抗體，對2月齡和11月齡的野生型小鼠的卵泡進(jìn)行Western Blot分析。
E. 使用抗MeCP2抗體對2月齡和11月齡的Ddx4-Rfp小鼠卵巢進(jìn)行免疫熒光染色。
F. (E)中卵母細(xì)胞MeCP2熒光強(qiáng)度的定量。
（2）MeCP2 過表達(dá)損害卵泡生長和存活
圖2：MeCP2在生長中的卵母細(xì)胞中過表達(dá)抑制卵泡生長。
B. 免疫染色顯示MeCP2過表達(dá)對次級卵泡生長中的卵母細(xì)胞DNA結(jié)構(gòu)（DAPI）的影響。
C. (B)中紅虛線指示的DAPI染色信號定量。
D. 在Flag或Flag-Mecp2 cRNAs過表達(dá)后第1、3和6天卵泡發(fā)育的代表性的明場顯微照片。
E. 對照組（n=32）或MeCP2過表達(dá)組（n=33）中，第1、3和6天的卵泡直徑定量。
F. 對照組或MeCP2度表達(dá)組（n=72-76）中，第1、3和6天的卵泡死亡率定量。
G,H. Ki67（G）和PCNA（H）在對照組和MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中的免疫熒光結(jié)果。
I. Western blotting結(jié)果顯示對照組和MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中的Ki67、Cleaved-PARP和FLAG表達(dá)。
J. MeCP2過表達(dá)卵泡卵母細(xì)胞中的γH2AX免疫熒光結(jié)果。
K. 在Flag或Flag-Mecp2（白色箭頭）cRNAs過表達(dá)后，同一圖像中生長中的卵母細(xì)胞的TUNEL免疫熒光結(jié)果。
L. 第6天卵泡培養(yǎng)基中雌二醇測量。
（3）MeCP2過表達(dá)誘導(dǎo)生長期卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)
圖3：MeCP2過表達(dá)誘導(dǎo)生長中的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄失調(diào)。
A. Ddx4-Rfp小鼠不同階段卵泡卵母細(xì)胞中pPSII的免疫熒光染色。白色箭頭指示原始卵泡。pPSII，C末端域Ser 5位點(diǎn)的磷酸化RNA聚合酶II。B. (A)中卵母細(xì)胞pPSII熒光強(qiáng)度定量。
C. 出生后第1天、5天和10天小鼠卵巢中pPSII的Western Blot分析。
D. 在Flag或Flag-Mecp2 mRNAs過表達(dá)1天后，用抗pPSII和5-乙炔基尿嘧啶（EU）對卵母細(xì)胞進(jìn)行免疫染色，以指示卵母細(xì)胞中的RNA轉(zhuǎn)錄活性。
E. (D)中pPSII和EU熒光信號強(qiáng)度定量。
F. Flag或Flag-Mecp2 mRNAs過表達(dá)后生長中的卵母細(xì)胞中pPSII蛋白水平的Western Blot結(jié)果
G. 散點(diǎn)圖顯示對照組（Ctrl）和MeCP2過表達(dá)（MeCP2 OE）卵母細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄變化。基因表達(dá)增加或減少超過兩倍分別用紅色和藍(lán)色表示。
H,I. MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中上調(diào)（H）和下調(diào)（I）的GO分析生物學(xué)過程富集。
J. MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中指示信號通路的GSEA富集圖和關(guān)鍵組分基因的箱線圖。
（4）MeCP2過表達(dá)誘導(dǎo)生長期卵母細(xì)胞DNA高甲基化
圖4：MeCP2在生長中的卵母細(xì)胞中過表達(dá)導(dǎo)致CpG島的DNA高甲基化。
A. 通過微量全基因組亞硫酸鹽測序（WGBS）對對照組和MeCP2過表達(dá)組卵母細(xì)胞樣本的主成分分析（PCA）（三個生物學(xué)重復(fù)）。B. 對照組和MeCP2過表達(dá)組卵母細(xì)胞樣本中mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
C. 密度圖顯示MeCP2過表達(dá)生長中的卵母細(xì)胞二價CpG島周圍的平均DNA甲基化增加。
D. 對照組和MeCP2過表達(dá)組生長中的卵母細(xì)胞內(nèi)基因體和2kb側(cè)翼（上游和下游）區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
E. 對照組和MeCP2過表達(dá)組生長中的卵母細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)座元件（TE）和2kb側(cè)翼區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
F. MeCP2過表達(dá)后上調(diào)和下調(diào)基因的基因體和啟動子區(qū)域內(nèi)mCpG、mCHG和mCHH的甲基化水平。
G. 維恩圖顯示差異表達(dá)基因（DEGs）與差異甲基化區(qū)域相關(guān)基因（DMGs）的交集。
H. （G）中交集基因的GO注釋的生物學(xué)過程。
I. 基因組瀏覽器綜合視圖顯示MeCP2過表達(dá)后甲基化水平增加和mRNA下調(diào)的Cldn34d基因。
（5）CRL4DCAF13靶向MeCP2在HeLa細(xì)胞中的泛素化和降解
圖5：MeCP2被多泛素化并通過CRL4DCAF13 E3連接酶降解。
A. 在10-μM MG132或MLN4924處理6小時和12小時后，Hela細(xì)胞MeCP2蛋白水平的Western Blot分析。B. 經(jīng)FLAG-GFP、FLAG-DCAF13、FLAG-DDB1和FLAG-CUL4A轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞MeCP2內(nèi)部和FLAG的免疫熒光結(jié)果。
C. 靶向陰性對照（siNC）、Dcaf13（siDcaf13）和Ddb1（siDdb1）的siRNAs轉(zhuǎn)染后Hela細(xì)胞指定蛋白的Western Blot分析。
D. 經(jīng)對照、FLAG-DCAF13和FLAG-DDB1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞，分別在0、6、12和24小時CHX處理的MeCP2、DDB1和DCAF13表達(dá)的Western Blot分析結(jié)果。
E. MeCP2與DCAF13、DDB1和CUL4A在Hela細(xì)胞中互作的免疫沉淀和Western Blot結(jié)果。
F. 免疫沉淀后進(jìn)行Western Blot分析，顯示對照Hela細(xì)胞以及指定蛋白編碼質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中MeCP2多泛素化。
（6）卵母細(xì)胞Dcaf13缺失導(dǎo)致MeCP2蛋白積累并抑制卵泡生長
圖6：Dcaf13基因敲除導(dǎo)致生長中的卵母細(xì)胞中MeCP2的積累和轉(zhuǎn)錄失調(diào)。
B. 21日齡的野生型（Dcaf13f/f）和Dcaf13 cKO（Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）小鼠卵巢的H&E染色代表性圖像。
C. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠卵母細(xì)胞中MeCP2、pPSII和DCAF13蛋白水平的Western Blot結(jié)果。
D. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次級卵泡中MeCP2表達(dá)的免疫熒光。
E. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的卵泡卵母細(xì)胞核中pPSII表達(dá)的免疫熒光結(jié)果。
F. (E)中pPSII熒光信號強(qiáng)度定量。
G. 野生型和Dcaf13 cKO小鼠的次級卵泡中，分別在siNC或siMecp2微注射后第1、3和6天的卵泡發(fā)育的明場圖像（每組n=2只小鼠）。
H. (G)中指定組的卵泡直徑定量。
I. 2月齡和11月齡小鼠卵母細(xì)胞中pPSII、DDB1和DCAF13表達(dá)的Western Blot結(jié)果。
（7）與染色質(zhì)共價修飾相關(guān)的DCAF13-MeCP2軸異常抑制翻譯和激活基因表達(dá)
圖7：DCAF13-MeCP2軸異常導(dǎo)致生長中的卵母細(xì)胞基因表達(dá)異常。
A. 野生型（WT, Dcaf13f/f）和Dcaf13條件性敲除（cKO, Dcaf13f/f; Gdf9-Cre）卵母細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄變化散點(diǎn)圖�；虮磉_(dá)增加或減少超過兩倍分別用紅色和藍(lán)色表示。B. 上方的維恩圖顯示Dcaf13 cKO上調(diào)基因與MeCP2過表達(dá)上調(diào)基因的重疊，而下方維恩圖顯示Dcaf13 cKO下調(diào)基因與MeCP2過表達(dá)下調(diào)基因的重疊。
C. 熱圖顯示Dcaf13 cKO或MeCP2過表達(dá)相對于各自對照后生長中的卵母細(xì)胞中下調(diào)和上調(diào)基因。
D. 通過基因本體（GO）分析獲得的MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中下調(diào)和上調(diào)的生物學(xué)過程富集，在Dcaf13 cKO卵母細(xì)胞中重疊。
E,F. 熱圖顯示MeCP2過表達(dá)卵母細(xì)胞中上調(diào)（E）和下調(diào)（F）基因的表達(dá)動態(tài)，這些基因在Dcaf13 cKO卵母細(xì)胞中重疊。
參考文獻(xiàn)：
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標(biāo)簽：
DNA甲基化
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