Ribo-seq與RNA-seq聯(lián)合分析揭示uAUG-ds翻譯調(diào)控機(jī)制

技術(shù)簡(jiǎn)介
RNA-seq主要從轉(zhuǎn)錄組水平分析基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，檢測(cè)用于核糖體翻譯的RNA序列及二級(jí)結(jié)構(gòu)。Ribo-seq主要用于檢測(cè)核糖體翻譯的起始位置、翻譯富集區(qū)和翻譯終止位置。RNA-seq與Ribo-seq聯(lián)合分析可以準(zhǔn)確檢測(cè)mRNA上游5’UTR區(qū)的uORFs翻譯調(diào)控結(jié)構(gòu)，揭示生物模式觸發(fā)免疫下的翻譯調(diào)控機(jī)制。
 
文獻(xiàn)速遞
2023年發(fā)表在Nature上的“Pervasive downstream RNA hairpins dynamically dictate start-codon selection”文章，發(fā)現(xiàn)在uORFs區(qū)的uAUGs下游存在雙鏈結(jié)構(gòu)，可動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)mORFs區(qū)蛋白的表達(dá)。文章主要提出了對(duì)防御性蛋白表達(dá)基因（順勢(shì)作用）的兩種調(diào)節(jié)狀態(tài)：

• 正常情況下，uAUG-ds結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)核糖體選擇性翻譯uORF，抑制下游mORFs翻譯，抑制防御性蛋白的表達(dá)。
• 在受到免疫攻擊后，誘導(dǎo)RNA解旋酶將uAUG-ds結(jié)構(gòu)打開，使核糖體可以繞過(guò)uAUGs，翻譯下游防御蛋白。

 
研究首先對(duì)正常處理和elf18誘導(dǎo)免疫處理的擬南芥樣本進(jìn)行RNA-seq和Ribo-seq測(cè)序。綜合RNA-seq數(shù)據(jù)和Ribo-seq數(shù)據(jù)，對(duì)檢測(cè)到的25,554個(gè)可表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行分析，篩選得到13,051個(gè)mAUGs上游5’UTR含有uAUGs的可表達(dá)轉(zhuǎn)錄物（含有uAUGs）。對(duì)比正常處理和elf18處理樣本的翻譯效率（TE），將這13,051個(gè)轉(zhuǎn)錄物分為TE-up、TE-nc和TE-down三組，通過(guò)GO分析發(fā)現(xiàn)了TE-up組基因與相應(yīng)環(huán)境脅迫等生物過(guò)程有關(guān)，而TE-down組基因主要是與生長(zhǎng)相關(guān)代謝過(guò)程有關(guān)（Extended Data Fig.2）。 Extended Data Fig. 2 Global analysis of translational dynamics and dual-luciferase reporter study of uAUG-containing transcripts.
 
為了鑒定uAUGs在翻譯調(diào)控中的作用，研究又從這13,051個(gè)轉(zhuǎn)錄物中篩選出翻譯型uAUGs，發(fā)現(xiàn)翻譯型uAUGs在TE-up組中顯著富集，表明了uAUGs在調(diào)節(jié)免疫相關(guān)翻譯中具有普遍作用（Fig. 1b）。研究還對(duì)比了正常處理和elf18誘導(dǎo)免疫處理下，TE-up組轉(zhuǎn)錄物中的翻譯型uAUGs特征，發(fā)現(xiàn)在正常處理下翻譯型uAUGs的翻譯起始率較高（核糖體占有率），而elf18處理后這種類型的uAUGs翻譯起始率顯著降低（Fig. 1e）。由于uAUGs起始的翻譯通常會(huì)抑制下游mORFs翻譯，所以在elf18處理下uAUGs起始的翻譯的減少也解除了對(duì)下游mORFs翻譯的抑制作用。 Fig. 1 Translational dynamics of uORF-containing transcripts.
 
為了確定uAUGs影響翻譯起始的機(jī)制，研究首先評(píng)估了所有表達(dá)轉(zhuǎn)錄本中的Kozak序列（一級(jí)結(jié)構(gòu)），發(fā)現(xiàn)mAUGs比uAUGs仍具有更好的Kozak序列，而且TE-up、TE-nc和TE-down轉(zhuǎn)錄物中翻譯型uAUGs的Kozak序列也是相似的（Fig. 2a），表明了在TE-up轉(zhuǎn)錄物中elf18介導(dǎo)的從uAUGs到mAUG的翻譯起始的轉(zhuǎn)換還與其他序列結(jié)構(gòu)有關(guān)。研究下一步使用SHAPE-MaP法來(lái)探究RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)翻譯起始識(shí)別的影響。研究定量檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的RNA結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)具有較高SHAPE反應(yīng)的區(qū)域更可能是單鏈結(jié)構(gòu)。研究進(jìn)一步使用正常處理和elf18處理樣本中mRNAs的數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)建模，發(fā)現(xiàn)盡管5’UTR取和CDSs區(qū)在SHAPE反應(yīng)上是相似的，但在所有表達(dá)轉(zhuǎn)錄物中mAUGs下游雙鏈結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)結(jié)合水平較高（低SHAPE反應(yīng)）（Fig. 2b）。研究同時(shí)對(duì)上下游核苷酸SHAPE反應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，mAUGs和翻譯型uAUGs下游比上游表現(xiàn)出明顯的低SHAPE反應(yīng)，而非翻譯型uAUGs沒(méi)有這種現(xiàn)象（Fig. 2c）。研究又對(duì)比了正常處理下和elf18處理下的不同轉(zhuǎn)錄效率（TE-up、TE-nc和TE-down）轉(zhuǎn)錄物種的uAUGs的SHAPE反應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)正常處理下TE-up轉(zhuǎn)錄物中的翻譯型uAUGs下游具有較低的SHAPE反應(yīng)，表明了uAUGs下游存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。研究通過(guò)缺乏蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)，排除蛋白質(zhì)結(jié)合導(dǎo)致低SHAPE反應(yīng)，進(jìn)一步確認(rèn)了雙鏈RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)（mAUG-ds和uAUG-ds）影響翻譯起始調(diào)控的可能性。
為了直接觀察結(jié)構(gòu)模式與AUGs的翻譯起始的關(guān)系，研究開發(fā)了基于一級(jí)序列和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的TISnet模型，來(lái)預(yù)測(cè)翻譯的起始位點(diǎn)。經(jīng)過(guò)mAUGs和internal AUGs數(shù)據(jù)訓(xùn)練的模型，可以預(yù)測(cè)到翻譯型uAUGs和非翻譯型uAUGs之間存在顯著差異（Extended Data Fig. 5d）。模型預(yù)測(cè)出的起始型uAUGs下游序列比非起始型具有更高的負(fù)折疊自由能（易形成二級(jí)結(jié)構(gòu)）（Fig. 2e）和更高的核糖體占有率（Fig. 2i），表明TISnet模型也可以準(zhǔn)確預(yù)測(cè)翻譯型uAUGs。以上研究表明了在正常情況下，AUGs下游RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)可以促進(jìn)該位置的翻譯起始，與上游RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)抑制翻譯起始相反。 Fig. 2 Global SHAPE-MaP and deep learning analyses reveal hairpin structures downstream of mAUGs and uAUGs that have a role in dictating translation initiation.
 
通過(guò)分析Ribo-seq數(shù)據(jù)，研究發(fā)現(xiàn)了TE-up轉(zhuǎn)錄物中elf18處理可以啟動(dòng)uORFs翻譯起始到mORFs翻譯起始的轉(zhuǎn)變。首先是觀察到在elf18處理下uAUGs下游SHAPE反應(yīng)增加（二級(jí)結(jié)構(gòu)解鏈），并且TE-up轉(zhuǎn)錄物uAUG-ds結(jié)構(gòu)變化受免疫誘導(dǎo)影響程度更大（Fig. 3a）。研究提出了假設(shè)，免疫誘導(dǎo)降低了uAUG-ds結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，啟動(dòng)下游mAUGs的翻譯。研究進(jìn)一步通過(guò)構(gòu)建uAUG2-ds突變表達(dá)系統(tǒng)，驗(yàn)證了uAUGs下游雙鏈結(jié)構(gòu)有助于通過(guò)促進(jìn)uAUGs的翻譯起始來(lái)抑制uORF介導(dǎo)的下游mORF翻譯。研究者還在植物和人細(xì)胞系中證實(shí)了這些結(jié)果，并通過(guò)對(duì)腫瘤抑制基因的突變體分析，發(fā)現(xiàn)了抑制BRCA1的mRNA翻譯的uAUGs-ds結(jié)構(gòu)（Fig.3g right）。 Fig. 3 RNA secondary structures downstream of uAUGs dynamically regulate translation.
 
接下來(lái)研究者試圖去了解elf18誘導(dǎo)是如何促進(jìn)uAUGs-ds解旋的。研究者主要選擇了DEAD-box RNA解旋酶進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)免疫誘導(dǎo)的解旋酶表達(dá)水平增加可能促進(jìn)uAUGs-ds的解旋，從而降低uAUG介導(dǎo)的mORF翻譯的抑制。研究通過(guò)構(gòu)建解旋酶表達(dá)系統(tǒng)證實(shí)了elf18誘導(dǎo)的RNA解旋酶參與了TE-up轉(zhuǎn)錄物中uAUG-ds的解旋，并促進(jìn)了下游防御蛋白的表達(dá)。
 
小結(jié)
研究使用RNA-seq、Ribo-seq和深度學(xué)習(xí)算法聯(lián)合分析了轉(zhuǎn)錄組范圍的翻譯和結(jié)構(gòu)特征，并且將結(jié)果擴(kuò)展到其他生物體中，揭示了uAUG-ds作為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的分子開關(guān)，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)防御性蛋白基因及腫瘤抑制基因的表達(dá)。