將1064nm激發(fā)用于光熱免疫測定的NIR-II吸收TMB衍生物

本文要點(diǎn)：在NIR-II區(qū)域表現(xiàn)出強(qiáng)吸收性的材料對(duì)基于光熱轉(zhuǎn)換的成像、診斷和治療具有吸引力，因?yàn)樵搮^(qū)域具有更好的熱效應(yīng)和更少的水吸收。3,3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺 （TMB） 是 ELISA 中的典型底物，因其氧化產(chǎn)物 （oxTMB） 在 NIR 區(qū)域具有光熱活性，因此已在光熱免疫測定中進(jìn)行了探索。然而，它在 1064 nm（光熱研究中最常用的激光波長）處的吸收并不明顯，因此限制了靈敏度的測定。在這里，我們提出了TMB（3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯(lián)苯胺，2-OCH3）在1064 nm激發(fā)光熱免疫測定中具有更高的NIR-II吸收。由于供電子基團(tuán)可以幫助減少分子的能隙（這里是 -CH3→ -OCH3），2-OCH3的氧化產(chǎn)物與oxTMB相比，表現(xiàn)出顯著的紅移吸收，導(dǎo)致在1064 nm處的吸收系數(shù)高出兩倍以上。因此，2-OCH3在光熱免疫測定 （PTIA） 中顯示出比 TMB 更高的靈敏度，前列腺特異性抗原 （PSA） 的檢測限 （LOD） 為 0.1 ng/mL。2-OCH3的可行性通過分析 61 份血清樣本中的 PSA，進(jìn)一步驗(yàn)證了基于 PTIA 的診斷�？紤]到其優(yōu)異的光熱性能，2-OCH3可以探索廣泛的光熱應(yīng)用。

 

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光熱效應(yīng)是指將光能轉(zhuǎn)化為熱能，表現(xiàn)出這種效應(yīng)的材料在生物檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。3′3′，5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）是ELISA中占主導(dǎo)地位的顯色底物，已廣泛應(yīng)用于各種分析檢測過程，其中 TMB在HRP催化劑（HRP-抗體偶聯(lián)物）存在下被 H2O2氧化。本文提出了一種新的TMB衍生物，該衍生物增強(qiáng)了其單電子氧化產(chǎn)物的NIR-II吸收，用于改進(jìn)光熱免疫測定（PTIA）。具體而言，將供電子甲氧基團(tuán)引入TMB框架的3-、3'-、5-和5'-位置，導(dǎo)致最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）之間的帶隙變窄，從而產(chǎn)生紅移吸收。兩種候選衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基聯(lián)苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯(lián)苯胺（4-OCH3），進(jìn)行了測試。在 NIR-II 窗口內(nèi)的 1064 nm 處，2-OCH3的單電子氧化產(chǎn)物， 2-OCH3·+，具有出色的光熱轉(zhuǎn)換效率 （η = 28.8%） 和 1.48 × 104M-1cm-1的摩爾吸收系數(shù) （ε）,表現(xiàn)出優(yōu)于 TMB 的性能。當(dāng)應(yīng)用于 PTIA 時(shí)，2-OCH3前列腺特異性抗原（PSA）的檢測限（LOD）為0.1 ng/mL，是TMB（LOD，0.27 ng/mL）的2.7倍。2-OCH3 的精度基于 PTIA 的 61 份血清樣本也得到了驗(yàn)證，顯示了其在醫(yī)學(xué)診斷中的潛力。

圖1. 具有增強(qiáng) NIR-II 吸收的 TMB 衍生物的設(shè)計(jì)和驗(yàn)證

 

為了提高1064nm處的吸光度，需要吸收的紅移。眾所周知，電子供體基團(tuán)的引入有助于減小最高占據(jù)分子軌道（HOMO）和最低未占據(jù)分子軌道（LUMO）之間的能隙，從而產(chǎn)生紅移吸收和發(fā)射。首先利用理論計(jì)算來預(yù)測原始襯底（TMB及其衍生物）及其單電子氧化產(chǎn)物（圖1A）的光譜特性。合成兩種TMB衍生物，即3,3′，5,5′-四甲氧基聯(lián)苯胺（2-OCH3）和3,3′-二甲氧基-5,5′-二甲基聯(lián)苯胺（4-OCH3）。隨后，TMB和合成衍生物的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了上述光譜學(xué)預(yù)測，即觀察到2-OCH的明顯紅移吸收3和 4-OCH3在TMB上（圖1D）。將反應(yīng)置于 H2O2-HRP氧化后，相應(yīng)氧化產(chǎn)物的吸收也大大紅移（圖1E）。例如，2-OCH的摩爾消光系數(shù)3(ε = 1.48 × 104M-1cm-1）在1064 nm處比TMB高兩倍以上（ε = 6.06 × 103M-1cm-1）。因此，這種簡單的結(jié)構(gòu)修飾有效地增強(qiáng)了TMB在1064 nm處的吸收，從而在理論上改善了衍生物的光熱響應(yīng)。

圖2. 基底的光熱性能

 

接下來，用紅外熱像儀進(jìn)行評(píng)估TMB，2-OCH3和 4-OCH3（之后 H 2O2-HRP氧化）的光熱能力。為了實(shí)現(xiàn)這樣的目標(biāo)，在功率密度為1.2 W/cm2 的  1064 nm 激光器下暴露50秒。如圖 2A所示，2-OCH3和 4-OCH3溫度分別上升了21.7和19.3 °C，大大高于TMB（11.7 °C）。詳細(xì)測試表明，在 1064 nm 處，2-OCH3的光熱響應(yīng)較強(qiáng)可歸因于其高光熱轉(zhuǎn)換效率（η=28.8%，圖2B，C）和摩爾消光系數(shù)（ε = 1.48 × 104M-1cm-1）。在連續(xù)五個(gè)激光開/關(guān)循環(huán)中，2-OCH3相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差 （RSD） 為 1.6%（圖 2E），也比 TMB （RSD = 3.58%，圖2D）更穩(wěn)定。當(dāng)比較信噪比時(shí)，2-OCH3在 TMB 和 4-OCH3中均表現(xiàn)出最佳性能 (圖2)此外，2-OCH3的氧化在不同量的HRP存在下具有高度的可重復(fù)性，表明2-OCH3是免疫測定的良好底物。因此，2-OCH3被選中進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)查。

圖3. 2-OCH3 氧化產(chǎn)物在 HRP-H2O2 系統(tǒng)中的表征

 

2-OC3的氧化產(chǎn)物可以以兩種形式呈現(xiàn)：單電子氧化產(chǎn)物（2-OCH3·+），也稱為電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物 （CTC） 和二亞胺二酰胺二分化 （2-OCH3+2).先前的研究表明，如果受體的電子親和力（ΔE）超過了供體（S）的HUMO和受體（S）的LUMO之間的能隙（ΔE）2+），電荷轉(zhuǎn)移將導(dǎo)致CTC的形成（圖3A）。證實(shí)了2-OCH3的氧化產(chǎn)物在 HRP-H2O2系統(tǒng)中確實(shí)是 2-OCH3·+，在NIR-II區(qū)域表現(xiàn)出很強(qiáng)的吸收性，以改善光熱應(yīng)用。

圖4. 2-OCH3 基于 PSA 檢測的 PTIA

 

在2-OCH3氧化產(chǎn)物具有優(yōu)異光熱性能的基礎(chǔ)上，評(píng)價(jià)了其在PTIA中的可行性。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，PSA被用作模型分析物，PTIA的構(gòu)建是通過在商業(yè)PSA試劑盒中用2-OCH3簡單地取代TMB來實(shí)現(xiàn)的（圖4A）。在PSA檢測之前，研究了一系列參數(shù)，包括pH、H2O2濃度、樣品體積、激光照射時(shí)間和緩沖液，以獲得最佳光熱響應(yīng)。在最佳條件下，溫度響應(yīng)與PSA濃度在0.31−20 ng/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系（圖4B）。建立的相關(guān)方程為y=1.19x+3.47，相關(guān)系數(shù)為0.995（圖4B）。與TMB（LOD，0.27 ng/mL）相比，在PTIA中使用2-OCH3（LOD：0.1 ng/mL）顯示出2.7倍的靈敏度提高，從而證實(shí)了2-OCH3在PTIA的優(yōu)越性能。與ELISA類似，基于2-OCH3的PTIA也表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性（圖4C）和長期穩(wěn)定性。

為了探索基于2-OCH3的PTIA的普遍性，還選擇CEA、IgG和GPC-3作為分析物進(jìn)行額外驗(yàn)證。與PSA測定類似，通過用2-OCH3取代TMB來調(diào)整用于這些分析物的市售試劑盒。、此外，對(duì)于所有這些分析物，觀察到比TMB底物更高的靈敏度。這些結(jié)果不僅證明了2-OCH3優(yōu)越的光熱效率，而且揭示了基于2-OCH3的PTIA在臨床診斷中的多功能性。

圖5. 用基于 PTIA 的 2-OCH3 檢測血清樣本中的人 PSA

 

人類血清中PSA的檢測。通過檢測臨床血清樣本中的PSA，驗(yàn)證了基于2-OCH3的PTIA的診斷能力。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，共收集了61份血清樣本，其中20份來自健康個(gè)體，41份來自診斷為前列腺癌癥的患者（表S6），并進(jìn)行了PTIA和ELISA檢測。如圖5A所示，從兩種方法獲得的結(jié)果之間存在高度相關(guān)性。受試者操作特征（ROC）分析顯示，PTIA（0.987）的曲線下面積（AUC）略好于ELISA（0.963），表明PTIA對(duì)前列腺癌癥診斷具有良好的準(zhǔn)確性（圖5B）。根據(jù)ROC曲線，ELISA和PTIA的診斷閾值分別為3.3 ng/mL和2.58 ng/mL�；煜�矩陣分析表明，PTIA的特異性為100%，靈敏度為92.7%（圖5D），而ELISA的特異性和靈敏度分別為100%和85.4%（圖5C）。這些結(jié)果證實(shí)了基于2-OCH3的PTIA在臨床診斷中的潛力。此外，在3周內(nèi)對(duì)同一樣品進(jìn)行重復(fù)分析后，發(fā)現(xiàn)RSD為8.1%，表明基于2-OCH3的PTIA具有良好的穩(wěn)健性。

本研究提出了一種新的光熱試劑（2-OCH3）基于用甲氧基取代TMB的甲基。與TMB相比，2-OCH3的單電子氧化產(chǎn)物表現(xiàn)出更高的摩爾消光系數(shù) （ε = 1.48 × 104M-1cm-1），從而產(chǎn)生高效的光熱轉(zhuǎn)換效率（η = 28.8%）。2-OCH3是TMB的衍生物，可直接替代目前ELISA試劑盒中的TMB進(jìn)行光熱免疫測定。在 PTIA 應(yīng)用中，2-OCH3在1064 nm激光器的刺激下，表現(xiàn)出比TMB更高的信噪比和靈敏度。由于信號(hào)讀出的簡單性和臨床應(yīng)用潛力，2-OCH3可作為基于 PTIA 的診斷的極好基材。考慮到2-OCH3出色的光熱性能TMB，在光熱療法中2-OCH3的應(yīng)用前景廣闊，也可以預(yù)期成像和其他相關(guān)應(yīng)用。

 

參考文獻(xiàn)

Henglin Liu, Xiao Zhang, Xianming Li, and Peng Wu. NIR-II-Absorbing TMB Derivative for 1064 nm-Excited Photothermal Immunoassay. Analytical Chemistry 2024 96 (14), 5633-5639

 

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