小鼠實(shí)驗(yàn)中PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR技術(shù)的介紹與應(yīng)用
瀏覽次數(shù):640 發(fā)布日期:2024-8-1
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最近很火的MBTI測試不知道大家都測試過了嗎?那么你是開朗外向的“E人”呢,還是善于觀察思考內(nèi)向的“I人”呢?
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看到這里的小伙伴都會有疑問了
什么是“P人呢”?
P就是在我們?nèi)粘?shí)驗(yàn),尤其是小鼠實(shí)驗(yàn)中的各種PCR包括:PCR、qPCR、RT-PCR、RT-qPCR等。下面我就一一為大家講解。
PCR
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,PCR的最大特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。由1983年美國Mullis首先提出設(shè)想,1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng),即簡易DNA擴(kuò)增法,意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到如今2013年,PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。1976年,中國科學(xué)家錢嘉韻,發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術(shù)發(fā)展也做出了基礎(chǔ)性貢獻(xiàn)。
DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈,在DNA聚合酶的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,加入設(shè)計(jì)引物,DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。主要反應(yīng)步驟可以總結(jié)為:高溫變性,低溫退火,中溫延伸。
① 高溫變性:通過高溫(約95℃)加熱一定時間,將模板DNA解離成單鏈的形式,以便與引物結(jié)合;② 低溫退火(復(fù)性):降溫至約55℃時,引物與模板DNA單鏈按照堿基互補(bǔ)配對原則結(jié)合;③ 中溫延伸:再將溫度調(diào)至約72℃(適合DNA聚合酶反應(yīng)的溫度),在Taq DNA聚合酶的作用下,DNA模板和引物結(jié)合物沿著磷酸到五碳糖(5'→3')的方向,按照堿基配對和半保留復(fù)制原則合成一條新的、與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。通過經(jīng)歷變性、退火和延伸幾個循環(huán)后,待擴(kuò)增的基因可以被擴(kuò)增放大幾百萬倍(1)。
這類PCR在小鼠中主要用于基因敲除和敲入小鼠等轉(zhuǎn)基因生物的基因型鑒定(2)。
當(dāng)然在開始PCR前DNA的抽提將決定整個實(shí)驗(yàn)的成敗,DNA的抽提方法及后續(xù)建議使用濃度可以參考我們之前的推文:
https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2382/post_type/1.html
在反應(yīng)過程中有的時候會發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了非預(yù)期條帶,那么可能是您的反應(yīng)體系存在污染,這部分內(nèi)容之前我們也有詳細(xì)的介紹如何避免污染哦:https://www.modelorg.com/portal/article/index/id/2384/post_type/1.html
qPCR
實(shí)時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中,以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。Real-timePCR是在PCR擴(kuò)增過程中,通過熒光信號,對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時期,模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系,所以成為定量的依據(jù)。
實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種:熒光探針和熒光染料。
1 TaqMan探針法:
探針完整時,報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。
2 SYBRGreenⅠ熒光染料法:
在PCR反應(yīng)體系中,加入過量SYBR熒光染料,SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,發(fā)射熒光信號,而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。
SYBR定量PCR擴(kuò)增熒光曲線圖
PCR產(chǎn)物熔解曲線圖(單一峰圖表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的單一性)
數(shù)據(jù)分析
通過實(shí)時熒光收集到的信號,儀器會自動繪制熒光曲線,通常5-15個循環(huán)的熒光信號都屬于背景信號,然后將其設(shè)置為擴(kuò)增曲線的背景或基線。在理想條件下,PCR產(chǎn)物量呈指數(shù)倍增長Yn=Y0×2^n(X0:初始模板量,n:PCR循環(huán)次數(shù),Yn:第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量)。但實(shí)際上可能引物模板引物消耗完,DNA聚合酶逐漸失活等原因,產(chǎn)物量就恒定。熒光強(qiáng)度就呈“S型”曲線即“擴(kuò)增曲線(Amplication plot)”,分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。再根據(jù)待測樣品的Ct,可計(jì)算樣品拷貝數(shù)/濃度。通常模板每稀釋10倍,CT值增大3.33。如果研究基因表達(dá)量通過比較達(dá)到設(shè)定熒光閾值所需的Ct值大小,可以比較出基因表達(dá)量的高低。
qPCR主要應(yīng)用:
1、普通基因表達(dá)水平的檢測:能夠快速準(zhǔn)確的定量出相關(guān)基因在不同組織或生命狀態(tài)下的相對表達(dá)水平,例如:CKO小鼠敲除效率的檢測。
2、基因拷貝數(shù)的檢測:能夠準(zhǔn)確的定量出相關(guān)基因在染色體中的拷貝數(shù)。
3、特殊RNA的轉(zhuǎn)錄水平檢測:根據(jù)特殊RNA的結(jié)構(gòu),如microRNA、circRNA等,設(shè)計(jì)其特殊引物,如莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物、反向引物等,對這類RNA的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定性、定量分析。
RT—PCR
RT—PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。整個反應(yīng)過程分為兩步,第一步是經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用,從RNA合成cDNA的過程;第二步是以cDNA為模板,在DNA聚合酶作用下擴(kuò)增目的片段的過程。
作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA,3種都可(3)。
RT-PCR其操作方法分為兩種,即一步法和兩步法。一步法RT-PCR,逆轉(zhuǎn)錄同PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起,即cDNA合成與PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一管Buffer及酶中進(jìn)行,一步完成。兩步法RT-PCR,RNA首先在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下生成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,分成兩步進(jìn)行。
RT—PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛,可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平、細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
RT-qPCR
定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR)是應(yīng)用于以RNA作為起始材料的PCR實(shí)驗(yàn)中的一種實(shí)驗(yàn)方法。在該方法中,總RNA或信使RNA(mRNA)首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA(cDNA)。隨后,以cDNA為模板進(jìn)行qPCR反應(yīng)。
RT-qPCR可通過一步法或兩步法來完成。一步法RT-qPCR把逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增結(jié)合在一起,使逆轉(zhuǎn)錄酶與DNA聚合酶在同一管內(nèi)同樣緩沖液條件下完成反應(yīng)。一步法RT-qPCR只需要利用序列特異性引物。在兩步法RT-qPCR中,逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增過程是在兩個管中完成,使用不同的優(yōu)化的緩沖液、反應(yīng)條件、以及引物設(shè)計(jì)策略。
RT-qPCR已被用于多種分子生物學(xué)的應(yīng)用中,其中包括基因表達(dá)分析、RNA干擾驗(yàn)證、微陣列驗(yàn)證、病原體檢測、基因測試和疾病研究(4)。
希望這篇“P文”能對您的實(shí)驗(yàn)有一定幫助,讓您成為一個合格的“P人”。最后,大家如果不想在PCR鑒定上浪費(fèi)時間,南模生物也可提供大小鼠基因型鑒定服務(wù),更多詳情請聯(lián)系我們。
1.多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)研究和應(yīng)用.中國知網(wǎng)
2.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org
3.胡奇林,林鋒強(qiáng),陳少鶯等. 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測番鴨呼腸孤病毒.《中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)》,2004
4.Bustin S. (ed) (2004) A-Z of Quantitative PCR.IUL Biotechnology Series, International University Line, La Jolla, California.
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上海南方模式生物科技股份有限公司(Shanghai Model Organisms Center, Inc.,簡稱"南模生物"),成立于2000年9月,是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司(股票代碼:688265),始終以編輯基因、解碼生命為己任,專注于模式生物領(lǐng)域,打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心,涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術(shù)平臺,致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。