通過通用化學平臺開發(fā)可激活的雙模態(tài)NIR-II探針

本文要點：NIR-II區(qū)域的可激活近紅外（NIR）成像對于深層組織生物分析物追蹤至關(guān)重要。然而，由于通用化學策略的可用性有限，設(shè)計此類探針仍然具有挑戰(zhàn)性。本文介紹了一個可激活探針的基礎(chǔ)平臺，使用分析物觸發(fā)的智能調(diào)制NIR-II發(fā)射的羅丹明雜交體的π偶聯(lián)系統(tǒng)。通過調(diào)整鄰羧基部分的親核性，實現(xiàn)了一種稱為“堅定推動打開和光推動鎖定”的電子效應(yīng)，這使得探針在感應(yīng)之前能夠完全螺旋環(huán)化，并且當輕推動苯胺氨基甲酸酯觸發(fā)器轉(zhuǎn)化為堅定推動的苯胺時，可以有效地形成兩性離子。該平臺在活小鼠中產(chǎn)生具有~50倍熒光和可激活光聲信號的雙模態(tài)NIR-II成像探針，超過了已報道的可激活信號通常低于10倍的探針。為了證明通用性，成功地設(shè)計了用于過氧化氫（H2O2）和硫化氫（H2S）的探針。本文設(shè)想廣泛采用化學平臺，在各種應(yīng)用中設(shè)計可激活的NIR-II探針。

 

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圖1. 熒光調(diào)諧策略

 

本文探討了各種鄰羧基團如何影響一對CS NIR衍生物的平衡：一個具有NHBoc，另一個具有NH2取代基位于熒光團的 C5 位置，模擬基于反應(yīng)的探針在感應(yīng)其生物靶標之前和之后的行為（圖 1B）。我們的研究揭示了C5取代基的供電子能力與鄰羧基部分的親核性之間的協(xié)同作用。這導致了理想匹配的電子效應(yīng)的鑒定，本文稱之為“穩(wěn)定的開啟和光推鎖定”（FOLL），表示 NHBoc 取代基誘導的螺旋環(huán)化在感應(yīng)和 NH2 之前感應(yīng)后的取代基誘導兩性離子，假設(shè)理想匹配的鄰羧基部分已經(jīng)到位。通過FOLL，在基于溶液和細胞的成像實驗中觀察到~50倍的熒光響應(yīng)。

將FOLL效應(yīng)轉(zhuǎn)化為優(yōu)化的羅丹明雜交體，其最大發(fā)射波長（920 nm）落入NIR-II窗口，本文建立了一個通用化學平臺，用于在活小鼠（SBR~50）中設(shè)計具有最小背景和超熒光信號的NIR-II探針。此外，該化學平臺中的這種螺旋環(huán)化-兩性離子平衡機制促進了其在可激活光聲成像中的應(yīng)用。作為驗證，作者成功開發(fā)了使用此平臺進行探測H2O2的探針。這使得內(nèi)源性H2O2的熒光和可激活光聲成像成為可能�；罴毎�和活小鼠的背景信號幾乎為零，證明了該平臺的可靠性。該平臺的潛在通用性也體現(xiàn)在成功構(gòu)建 H2S 探針。

圖2. 調(diào)整鄰羧基部分以獲得有效的 FOLL 效果

 

本文使用 CS NIR 熒光團作為模型開始研究，因為它易于合成。鑒于分析物觸發(fā)的從苯基氨基甲酸酯到苯胺的轉(zhuǎn)化在檢測酶活性、反應(yīng)性代謝物或金屬離子方面的廣泛適用性，作者戰(zhàn)略性地將兩種取代基引入熒光團的 C5 位置：無電子供體 NHBoc 基團和提供 NH2 的電子組（圖 2A）。該做法的目標有兩個：（i）模擬探針在感測目標之前和之后的結(jié)構(gòu)變化，以及（ii）模擬熒光團核心在感應(yīng)前后的不同親電性。目標是確定一種鄰位羧基部分，該部分有利于 NHBoc 取代結(jié)構(gòu)的最大螺旋環(huán)化（“輕推鎖定”效應(yīng)）和 NH2- 的最大兩性離子形成替代對應(yīng)物（“堅定推動打開”效應(yīng)）。

作者最初合成了以羧酸為鄰羧基部分的 C1 化合物（圖 2B）。熒光光譜測量顯示，NHBoc-C1在近紅外范圍內(nèi)有中等背景信號，表明螺旋環(huán)化效率低下，其在該范圍內(nèi)的顯著吸收進一步支持了這一點。這與羧酸有限的親核性一致。為了增強螺環(huán)化傾向，將羧酸基團轉(zhuǎn)化為親核性更強的N-甲基酰胺。雖然這種轉(zhuǎn)變完全消除了 NHBoc-C2 近紅外范圍內(nèi)的背景熒光，但它阻礙了 NH2- 中兩性離子的形成由于N-甲基酰胺的高親核性而取代的對應(yīng)物（圖2C）。

然后，通過降低氮原子的電子密度或增加其周圍的空間效應(yīng)來微調(diào)酰胺基團的親核性。這導致了另外七對化合物（C3至C9）的合成，并記錄了它們的熒光光譜（圖2，D至J）。由于傳統(tǒng)羅丹明的螺環(huán)化-兩性離子平衡對pH變化敏感，我們使用pH 7.4下NH2/NHBoc對的近紅外吸收強度比作為兩性和螺環(huán)形式之間探針平衡變化的粗略估計（圖2K和圖S15），并通過高斯計算將這些數(shù)據(jù)與酰胺氮原子的計算電子密度相關(guān)聯(lián)（圖S16和表S2）（48），間接測量了親核性。如圖2K所示，具有最低和最高親核性的羧基團都具有較低的信噪比。由于螺旋環(huán)化有限，較差的親核試劑無法有效抑制NHBoc取代結(jié)構(gòu)中的背景信號，而強親核試劑無法在NH2-中實現(xiàn)靈敏的熒光信號由于兩性離子形成有限而取代的結(jié)構(gòu)。在測試的化合物中，C5對具有鄰羧基部分作為�；�磺酰胺的C5對表現(xiàn)出最明顯的可激活熒光（圖2L），NH2與NHBoc-C5相比，-C5的量子產(chǎn)率增加了7倍。

為了進一步驗證 FOLL 效應(yīng)誘導的高 SBR 的功效，作者用三對化合物（C2、C5 和 C6）對活細胞進行染色，其中 NHBoc 取代的化合物代表感應(yīng)前的探針，而 NH2-取代化合物代表感應(yīng)后的探針。用 C6 對結(jié)構(gòu)染色的細胞表現(xiàn)出均勻的強熒光，與 NHBoc-C6 相比，僅觀察到 NH 2-C6的 1.5 倍信號適度增加。相反，用C2對化合物染色的細胞保持非熒光，與光譜測量一致。正如預期的那樣，用 C5 對化合物染色的細胞表現(xiàn)出異常的熒光反應(yīng)，NHBoc-C5 顯示幾乎為零的背景信號和 NH2-C5 表現(xiàn)出明顯的熒光（~50 倍）（圖 2、M 和 N ）。這些發(fā)現(xiàn)進一步驗證了作者的FOLL策略在設(shè)計高熒光探針方面的成功。

在確定了合適的鄰羧基團后，我們的下一個目標是優(yōu)化羅丹明雜化聚甲基染料的熒光特性。我們的策略包括探索硫取代和共軛延伸，以設(shè)計具有NIR-II發(fā)射的熒光團。我們設(shè)計了四種結(jié)構(gòu)，并通過Knoevenagel反應(yīng)合成了它們（圖3A）。在檢查它們的吸收、熒光和光聲光譜（圖3，B至I）后，很明顯，D4表現(xiàn)出最多的紅移吸收、發(fā)射和光聲信號。D4 表現(xiàn)出超出 900 nm 范圍的尾狀吸收和巨大的光聲強度。鑒于 D4 在 C5 位置具有羥基取代基，選擇D4作為候選熒光團，用于構(gòu)建用于設(shè)計熒光探針的通用化學平臺。

圖3. 調(diào)整羅丹明雜化聚亞甲基染料的NIR-II發(fā)射

 

作者的下一步是評估 C5 中酰基磺酰胺的親核性與苯胺衍生的 D4 熒光團的相容性。合成了化合物 NHBoc-D4 和 NH2-D4，摻入鄰酰基磺酰胺部分（圖4A）。通過比較這對化合物的吸收和熒光光譜，我們發(fā)現(xiàn)FOLL效應(yīng)在該熒光基團中表現(xiàn)出比CS NIR熒光團更大的功效。如圖4（B和C）所示，NHBoc-D4在近紅外范圍內(nèi)的吸收和發(fā)射幾乎為零，而NH2-D4 在此范圍內(nèi)表現(xiàn)出強烈的吸收和熒光。

作者進一步驗證了這對結(jié)構(gòu)在活細胞和活小鼠中的顯著成像對比度。用 NHBoc-D4 染色的細胞沒有可見熒光，而用 NH2-D4 染色的細胞顯示明顯的熒光;并觀察到~28倍的熒光信號（圖4，D和E）。同樣，在將探針注射到活小鼠腫瘤中后，在 NHBoc-D4 組中沒有觀察到信號，而 NH2-D4組表現(xiàn)出明顯的信號（~50倍）（圖4，F(xiàn)和G）。作者觀察到，在靜脈給藥時，NH2-D4 顯示全身分布曲線。在處死小鼠并使用NIR-II成像系統(tǒng)檢查各種器官后，在NHBoc-D4組的器官中未檢測到可辨別的熒光信號。相比之下，來自 NH 2-D4的所有器官組表現(xiàn)出明顯的信號，其中肝臟的信號最為突出。兩組之間的對比在不同器官中有所不同，這歸因于探針的局部濃度不同。

鑒于 NHBoc-D4 和 NH 之間的近紅外吸收形成鮮明對比2-D4，在腫瘤內(nèi)施用探針時對小鼠進行了光聲掃描。橫截面圖像顯示NHBoc-D4組沒有信號，而NH2-D4組表現(xiàn)出明顯的信號（~50倍）（圖4，H和I），與熒光成像觀察到的結(jié)果一致。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，NH2-D4應(yīng)通過轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的氨基甲酸酯，成為構(gòu)建高熒光NIR-II探針的理想化學平臺。此外，可以同時實現(xiàn)可激活的光聲成像。值得注意的是，在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中100μM的NH2-D4對20當量的高氧化物種如ONOO-和NaClO的處理是穩(wěn)定的。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了這種化學平臺在廣泛的生物應(yīng)用中的多功能性和潛力。

圖4. 開發(fā)用于熒光NIR-II成像的化學平臺

 

苯硼酸酯部分作為感測H2O2的化學觸發(fā)器有著悠久的歷史。因此，我們將NH2-D4熒光團轉(zhuǎn)化為硼苯氧基氨基甲酸酯。該探針被標記為H2O2-D4（圖5A），測試了其對H2O2的反應(yīng)。H2O2-D4顯示出以500nm為中心的最大吸收帶，表明其以螺環(huán)形式存在。與H2O2相互作用后，以500nm為主的吸光度降低，同時出現(xiàn)了以790和900nm為中心的兩個相鄰峰（圖5B）。這一轉(zhuǎn)變表明H2O2觸發(fā)了兩性離子的形成。值得注意的是，吸光度的減少和增加都與施加的H2O2劑量成正比（圖5C）。動態(tài)記錄表明，H2O2與H2O2-D4的傳感在1小時內(nèi)完成（圖5C）。液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析進一步證實了這一觀察結(jié)果（圖5E），顯示H2O2-D4在與H2O2相互作用1小時內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為NH2-D4。在不同的生物相關(guān)pH水平下進行了傳感反應(yīng)（圖5F）。觀察到探針在測試的pH值水平下保持黑暗。然而，H2O2相互作用后的傳感信號隨著pH值的增加而增強。由于我們已經(jīng)證實NH2-D4的螺環(huán)化兩性離子平衡對pH不敏感，這一觀察結(jié)果歸因于在更堿性的條件下，探針更有效地轉(zhuǎn)化為NH2-D4，這是由H2O2的反應(yīng)性增強和自焚連接體的加速切割共同驅(qū)動的。此外，證實了探針對H2O2的高選擇性，因為其他反應(yīng)性物質(zhì)對其吸收幾乎沒有變化（圖5D）。同樣，在與H2O2相互作用時，觀察到探針的高度熒光反應(yīng)（圖5，G和H）。值得注意的是，由于螺環(huán)化在NIR-II區(qū)域誘導了有效的熒光淬滅，通過補充材料中詳述的3SB/K方法，H2O2-D4可以實現(xiàn)7.0 nM的H2O2檢測限。

圖5. H2O2型可激活探針驗證研究

 

在成功評估了探針在基于水溶液的測定中對 H2O2 的性能，并確認了其在培養(yǎng)細胞（圖S28）和小鼠（圖 S29）中的安全性之后，我們的下一步是使用該探針對生物樣品中的H2O2 進行成像。我們首先用不同濃度的H2O2 刺激培養(yǎng)細胞 3 小時，以誘導急性氧化應(yīng)激。隨后，清洗細胞，用 H2O2-D4 染色，然后進行成像。觀察到細胞熒光隨著 H2O2濃度的變化而呈劑量依賴性增加（圖 6、A 和 B）。值得注意的是，與陰性對照組相比，在存在 H2O2（1.0 mM）的情況下，細胞探針熒光增加了約 15 倍。將研究擴展到另一種涉及百草枯誘導的急性氧化應(yīng)激的模型。在這種設(shè)置中，細胞最初用不同濃度的百草枯處理 3 小時，然后清洗、用探針染色，然后成像。與 H2O2處理組類似，我們觀察到細胞探針熒光隨著百草枯濃度的變化而呈劑量依賴性增加（圖 6、C 和 D）�？偟膩碚f，這些結(jié)果表明 H2O2-D4能夠通過其熒光信號評估細胞氧化應(yīng)激水平的程度，從而為監(jiān)測活細胞中的氧化應(yīng)激動態(tài)提供了有價值的工具。

圖6. 活細胞和小鼠中的 H2O2 可激活成像

 

基于細胞研究中獲得的有希望的結(jié)果，我們繼續(xù)評估H2O2-D4在異種移植4T1腫瘤小鼠模型中成像H2O2的可行性。然后，進行實時NIR-II熒光成像，以監(jiān)測和量化活體小鼠腫瘤內(nèi)注射探針后H2O2激活探針熒光信號的增強（圖6E）。記錄7小時后，腫瘤部位的NIR-II熒光大約比背景高50倍（圖6F），這代表了有史以來最高的SBR。此外，作者還探討了該探針在H2O2可激活光聲成像中的適用性。與NIR-II熒光成像結(jié)果類似，觀察到小鼠腫瘤部位光聲信號隨時間增加，幾乎沒有背景信號干擾，8小時后SBR達到50（圖6，G和H）。

受H2O2-D4成功應(yīng)用的鼓舞，我們開始探索設(shè)計可激活NIR-II探針的化學平臺的普遍適用性。其中一個重要的目標分子是H2S，它是生命系統(tǒng)中的內(nèi)源性氣體信號分子，在多種生理過程中起著關(guān)鍵作用。通過將H2S響應(yīng)觸發(fā)器引入NH2-D4熒光團，開發(fā)了H2S傳感探針，表示為H2S-D4（圖7A）。

作者的初步研究旨在評估探針對水溶液中H2S的傳感性能。吸收光譜顯示，H2S-D4在近紅外范圍內(nèi)沒有表現(xiàn)出明顯的吸收（圖7B），表明更傾向于螺環(huán)形式。然而，在暴露于H2S后，作者觀察到近紅外吸收的劑量依賴性增強，表明向兩性離子形式的轉(zhuǎn)變。這種轉(zhuǎn)變也被發(fā)現(xiàn)與孵育時間有關(guān)（圖7C）。此外，作者證實了探針對H2S的高選擇性（圖7D），與報道的苯基疊氮化物部分對H2S的選擇性一致。與吸收分析平行，熒光光譜測量表明探針對H2S有顯著的熒光反應(yīng)（圖7E），檢測限確定為23 nM。使用了高效液相色譜（HPLC）分析，為H2S觸發(fā)的氨基甲酸酯探針轉(zhuǎn)化為NH2-D4熒光團（圖7F和）。

細胞首先用NaHS（1 mM）作為H2S供體處理3小時，進行H2S-D4染色（5μM）不同時間，然后成像。結(jié)果顯示，染色時間依賴性細胞探針熒光增強（圖7、G和H），表明細胞H2S-D4持續(xù)轉(zhuǎn)化為NH2-D4。在另一個實驗中，細胞用不同劑量的NaHS（0、0.5和1 mM）處理3小時，然后用H2S-D4孵育90分鐘，然后成像。細胞探針熒光信號以NaHS劑量依賴的方式增強，表明其能夠?qū)�活細胞中不同的H2S濃度做出反應(yīng)（圖7、I和J）。這一結(jié)果表明，探針H2S-D4對內(nèi)源性H2S生成的成像足夠敏感。

圖7. 用于成像H2S的可激活探針

 

本文通過結(jié)合分析物觸發(fā)的電子效應(yīng)與鄰羧基部分的親核性進行了系統(tǒng)研究。使用羅丹明雜交物作為模型化合物，使用 5-NHBoc 取代的衍生物在感應(yīng)生物靶標之前模擬探針，使用 5-NH2–感應(yīng)后代表產(chǎn)品的替代對應(yīng)物。通過仔細調(diào)整正羧基部分，確定了一種理想匹配的電子效應(yīng)——用力推動打開，輕推鎖定。這種效應(yīng)確保了探針在感應(yīng)前的最佳螺旋環(huán)化和感應(yīng)后的最大兩性離子特性。

此外，通過結(jié)構(gòu)改性來改進混合物的發(fā)射特性，我們確定了NH2-D4 作為具有 NIR-II 區(qū)域發(fā)射能力的熒光團。選定的鄰羧基團完美地補充了該熒光團。雖然 NHBoc-D4 表現(xiàn)出可忽略不計的 NIR 吸收，這意味著完全螺旋環(huán)化，但 NH2-D4顯示出大量的近紅外吸收率。小鼠活體成像證實了NH2-D4與 NHBoc-D4 相比的高熒光和可激活光聲信號。

最后，驗證了 NH2-D4 熒光團作為 NIR-II 范圍內(nèi)可激活光學探針的直接設(shè)計的化學平臺的適用性和通用性。我們通過將 NH2-D4 中的胺基簡單地衍生為相應(yīng)的 H2O2或 H2S 響應(yīng)氨基甲酸酯，成功開發(fā)了超靈敏的熒光 NIR-II 探針。還發(fā)現(xiàn)這些探針與可激活光聲成像兼容。此外，還實現(xiàn)了小鼠腫瘤組織或受損肝臟的活體成像。因此，該平臺代表了一種設(shè)計可激活 NIR-II 探針的直接方法，可在 NIR-II 光譜中實現(xiàn)雙模態(tài)成像。

 

參考文獻

Lili Shen et al., A firm-push-to-open and light-push-to-lock strategy for a general chemical platform to develop activatable dual-modality NIR-II probes. Sci. Adv.10,eado2037 (2024).

 

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