HepG2細胞培養(yǎng)技巧
其廣泛應(yīng)用于遺傳毒理學(xué)試驗、外源性生物性異物的細胞毒性、乙型肝炎病毒感染機制、病毒培養(yǎng)等方面的研究。由于其與肝細胞具有相同的生物學(xué)活性，還被用于胰島素抵抗的研究。本文對肝癌細胞培養(yǎng)的最佳條件做一簡單綜述。
1. HepG2細胞的復(fù)蘇條件
1.1 復(fù)蘇溫度的選擇
采用下述方法進行細胞復(fù)蘇：快速將所凍存細胞40℃水浴搖床60轉(zhuǎn)/ min慢搖至其溶解，溶解后馬上轉(zhuǎn)入 37 ℃水浴箱，手工慢搖恒溫 2～3min復(fù)蘇 ,復(fù)蘇后 800 轉(zhuǎn)/ min 離心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)基 ,混勻后加入細胞培養(yǎng)板 ,每孔 1 ml，5% CO₂溫箱 37℃培養(yǎng)。上述方法與細胞專著所述方法相比較，傳統(tǒng) 37 ℃水浴方法復(fù)蘇后細胞存活率為 68.4%，先40℃溶解后37℃恒溫方法復(fù)蘇后細胞存活率為85.7%。證明其所用方法優(yōu)于傳統(tǒng)方法。1.2 復(fù)蘇用培養(yǎng)基的選擇
使用培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI-1640和DMEM兩種培養(yǎng)基對HepG2細胞進行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞結(jié)果在接種密度為1×10^4/c㎡、血清含量為15%時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞開始貼壁，12h后大部分細胞貼壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例傳代。而用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞在接種密度為1×10^4/c㎡、血清含量為20%時，時，經(jīng)6h培養(yǎng)后細胞貼壁不明顯，但12h后部分細胞貼壁，24h后亦大部分細胞貼壁，且增值速度相對較慢，5天后可以按1:3的比例進行傳代。以上結(jié)果說明，使用DMEM培養(yǎng)基既可以節(jié)省血清，細胞貼壁所用時間短、增殖速度快，并且傳代細胞培養(yǎng)也使用DMEM培養(yǎng)基，使用DMEM培養(yǎng)基進行復(fù)蘇，避免了配制不同培養(yǎng)基所帶來的麻煩，因此在HepG2細胞復(fù)蘇中推薦使用DMEM培養(yǎng)基。
1.3 復(fù)蘇時的接種密度
研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)接種密度為1×10^4/c㎡，血清含量為20%時, 細胞24 后大部分貼壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例傳代；當(dāng)接種密度大于1×10^4/c㎡和（或）血清含量少于20%時, 細胞表現(xiàn)為貼壁困難, 出現(xiàn)進行性退化; 當(dāng)接種密度小于1×10^4/c㎡ 血清含量為20%時, 細胞24h后大部分貼壁, 但增殖速度明顯減慢, 約7d后才可按1:3比例傳代。
2. 消化酶及消化時間的選擇研究發(fā)現(xiàn)，EDTA+胰酶的消化能力太強，消化時間不好把握，傳代消化后細胞死亡較多；EDTA消化能力太弱，消化時間太長且不易將細胞消化完全;用PBS將細胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆蓋細胞約30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，顯微鏡下可觀察到細胞消化適度。將待傳代細胞不用PBS洗滌和用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后分別用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化（消化液用量為蓋滿瓶底），觀察時間為30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分鐘。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不用PBS洗滌的細胞分別用上述兩種酶消化，10分鐘后細胞仍然消化不完全。
用pH7.2的PBS洗滌一遍、二遍、三遍后的細胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化時，分別經(jīng)3分鐘、1分鐘和0.5分鐘能完全消化好細胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液進行消化時，完全消化好細胞約需3分鐘、1.5分鐘、1分鐘。二者的結(jié)果相符。根據(jù)上述結(jié)果可知，在進行HepG2細胞的消化時，先用pH7.2的PBS洗滌三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分鐘效果比較好。
推薦使用如下方法進行消化：效果明顯，對細胞的影響小。一般適宜的消化方法是：用1×PBS將細胞洗滌2次 再加入適量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）覆蓋細胞約20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的體積比混合）。
3. 培養(yǎng)基中血清濃度的選擇
由于人肝癌細胞株生長緩慢，惡性程度較高，對于血清的要求比較嚴格，其培養(yǎng)時所需要胎牛血清的濃度要比一般的腫瘤細胞高一些。在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中HepG2人肝癌細胞生長迅速。血清含量為20%時, HepG2細胞貼壁后增殖速度最快。當(dāng)HepG2細胞增殖數(shù)代后, 待其狀態(tài)穩(wěn)定時, 可將血清含量逐漸降至10%。
4. 雙抗?jié)舛鹊倪x擇
通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，雙抗?jié)舛葹?.5%時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長。
5. 培養(yǎng)基pH條件的選擇
實驗發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇細胞和傳代細胞在pH6.8-7.4、5% CO₂條件下培養(yǎng)，其貼壁和增值速度無明顯變化。
而無CO₂條件下培養(yǎng)時，復(fù)蘇細胞在不同pH值條件下均表現(xiàn)為培養(yǎng)液逐漸變堿性，細胞不能貼壁，且逐漸縮小，退化；傳代細胞在不同pH值條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)液逐漸變酸性,當(dāng)pH值﹥7.0時，經(jīng)24h培養(yǎng)后，細胞基本貼壁，但增值緩慢，經(jīng)48h培養(yǎng)后大部分細胞已伸出偽足，細胞數(shù)量明顯增多；當(dāng)pH值﹤7.0時，細胞貼壁困難，經(jīng)72h培養(yǎng)后，細胞縮小、呈退化趨勢。通過正交實驗優(yōu)選發(fā)現(xiàn)，pH7.2時傳代效果較好，條件易于控制，且細胞能順利生長，與上述結(jié)果相符。6. 細胞傳代條件的選擇
通過正交實驗對HepG2細胞的傳代條件進行優(yōu)選，推薦在細胞匯合度達95%-100%時進行傳代。
研究結(jié)果表明HepG2 細胞生長至匯合度50%～95%時是對數(shù)生長期,死細胞相對較少;而當(dāng)匯合度達到 100%時 ,生長趨于平臺期 ,死細胞數(shù)開始增加;特別是匯合度 100%以后再繼續(xù)培養(yǎng),死細胞數(shù)明顯增加而活細胞數(shù)減少。據(jù)此可確定 HepG2 細胞培養(yǎng)最佳的傳代時期是在匯合度 95%～100%之間。二者的實驗結(jié)果相符，推薦在匯合度在95%-100%時進行細胞傳代。
