專訪梁思佳：抑制動(dòng)脈粥樣硬化潛在治療靶點(diǎn)NFATc3

中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院梁思佳老師致力于代謝性心血管疾病，特別是高脂血癥誘導(dǎo)的心血管相關(guān)疾病致病機(jī)制的研究，系統(tǒng)研究心血管系統(tǒng)鈣池操縱性鈣通道和鈣激活氯通道在疾病中的病理學(xué)意義。近年來梁思佳老師在抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)上取得重大進(jìn)展，并在European Heart Journal（IF=35.86）上發(fā)表重要研究論文，表明 NFATc3可能是抗動(dòng)脈粥樣硬化的潛在治療靶點(diǎn)，基于該研究論文中應(yīng)用基因編輯小鼠模型研究NFATc3基因參與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生機(jī)制的思路與策略，賽業(yè)生物首席科學(xué)家俞曉峰博士，對(duì)中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院梁思佳老師進(jìn)行了特邀專訪。
 

俞博士：我們知道，ApoE和Ldlr基因敲除（KO）是動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的常見疾病模型，梁老師的此研究項(xiàng)目中為什么會(huì)選擇NFATc3基因在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致病作用機(jī)制開展如此深入探討研究，能否介紹一下其背后的理論及臨床方面的相關(guān)依據(jù)？

梁老師：我們團(tuán)隊(duì)一直在圍繞離子通道與代謝性心血管疾病做系統(tǒng)的研究，其中在針對(duì)鈣信號(hào)與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系研究的前期工作中發(fā)現(xiàn)，鈣池操縱性鈣通道介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。有意思的是，該鈣信號(hào)的下游機(jī)制是通過激活Calcineurin-ASK1-MAPK信號(hào)發(fā)揮上述作用，而非通過經(jīng)典的下游信號(hào)NFAT。恰恰相反，NFAT信號(hào)的激活加速了泡沫細(xì)胞的形成。我們通過對(duì)NFAT家族成員（NFATc1-4）之一的NFATc3表達(dá)量比較研究發(fā)現(xiàn)，與正常人群相比，NFATc3基因表達(dá)在臨床上動(dòng)脈粥樣硬化患者人群中明顯降低。而在高脂飼養(yǎng)ApoE敲除小鼠誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型中也發(fā)現(xiàn)NFATc3基因表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。另外，非常值得注意的是，目前我們對(duì)器官移植患者的臨床監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，使用抑制NFAT信號(hào)的環(huán)孢霉素A等常用免疫抑制劑來發(fā)揮免疫抑制作用，進(jìn)而誘發(fā)移植患者出現(xiàn)高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化等藥物副作用，已成為器官移植失敗導(dǎo)致死亡的最主要誘因。

關(guān)于上述免疫抑制劑應(yīng)用中的不良反應(yīng)，是否與抑制Calcineurin-NFAT有直接關(guān)聯(lián)，尚一無(wú)所知。因此，圍繞以上前期相關(guān)工作提示和臨床現(xiàn)象，我們關(guān)注了NFATc3基因的功能研究，并深入開展了后續(xù)的作用機(jī)制探討，這份工作首次闡明了NFATc3基因在動(dòng)脈粥樣硬化致病過程中重要作用的關(guān)鍵因素，并揭示了在臨床免疫抑制劑應(yīng)用中，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化副作用的新機(jī)制。這份研究有望為今后提高心臟移植患者生存率，延長(zhǎng)免疫抑制藥物作用時(shí)間，以及人工心臟使用壽命等治療方案的研究提供了臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

俞博士：梁老師在該研究中應(yīng)用了NFATc3基因編輯小鼠疾病模型，探討與揭示該基因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化致病作用，為什么會(huì)選擇性將該基因在巨噬細(xì)胞中特異性敲除？

梁老師：我們知道巨噬細(xì)胞泡沫化是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵因素，其在動(dòng)脈粥樣硬化形成中的重要性，以及它們?cè)诎邏K內(nèi)的富集，使巨噬細(xì)胞成為動(dòng)脈粥樣硬化的有希望的治療靶點(diǎn)。 而且，我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)NFATc3 表達(dá)在人和小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)的巨噬細(xì)胞中降低。這種表達(dá)水平的降低主要體現(xiàn)在巨噬細(xì)胞核內(nèi)聚積的減少，且與臨床動(dòng)脈粥樣硬化患者斑塊不穩(wěn)定性呈密切負(fù)相關(guān)。然而高脂等動(dòng)脈粥樣硬化刺激對(duì)NFAT家族其他亞型在巨噬細(xì)胞細(xì)胞中的核定位并沒有顯著影響。因此，我們的工作把NFATc3主要聚焦在單核巨噬細(xì)胞功能調(diào)控上。

俞博士：在研究基因組織細(xì)胞特異性功能作用的時(shí)候，一般會(huì)采用條件性基因敲除（cKO），或者條件性過表達(dá)的策略構(gòu)建相應(yīng)小鼠模型，而梁老師在該研究中，不僅構(gòu)建了該基因的cKO小鼠模型，為什么還要構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)NFATc3基因小鼠模型？

梁老師：構(gòu)建巨噬細(xì)胞特異性過表達(dá)NFATc3基因小鼠模型是為了探究巨噬細(xì)胞過表達(dá)NFATc3基因后，能否產(chǎn)生與巨噬細(xì)胞特異性敲除NFATc3相匹配的表型效應(yīng)，從而去驗(yàn)證NFATc3基因在動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程中的關(guān)鍵作用。除此之外，我們還通過骨髓移植的方式，進(jìn)一步去證明NFATc3在單核巨噬細(xì)胞中的關(guān)鍵作用。

俞博士：我注意到梁老師在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化小鼠疾病模型建立中，是采用在NFATc3基因巨噬細(xì)胞特異性敲除小鼠上，再導(dǎo)入AAV8-CD36-hPCSK9-D374Y (hPCSK9DY）突變體巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的策略，這是不是間接表明，NFATc3基因在小鼠巨噬細(xì)胞中敲除，需要加上hPCSK9DY條件性表達(dá)的協(xié)同作用，才能誘導(dǎo)小鼠形成冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的表型？如果采用NFATc3 cKO小鼠與ApoE/Ldlr KO交配的方式獲得雙基因敲除小鼠模型，是否也有可能開展類似致病作用機(jī)制的研究？

梁老師：我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，單純敲除或高表達(dá)巨噬細(xì)胞NFATc3不影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，也就說明巨噬細(xì)胞敲除NFATc3并不能自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。與絕大部分研究相似，這需要在ApoE/Ldlr 敲除背景下進(jìn)行相關(guān)研究。PCSK9突變體誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化是近來年相關(guān)領(lǐng)域越來越常用的一種技術(shù)手段。PCSK9DY是前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶Kexin-9第374位天冬氨酸突變?yōu)槔野彼岬墓δ塬@得性突變體，通過高效降解LDLR提高LDL-C水平，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成，其作用與Ldlr -/-小鼠誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化的原理相似。這種動(dòng)脈粥樣硬化模型誘導(dǎo)方式可以極大節(jié)省基因修飾動(dòng)物與ApoE/Ldlr敲除小鼠雜交所需時(shí)間，尤其是條件特異性表達(dá)小鼠。

俞博士：你們的研究揭示了NFATc3通過調(diào)節(jié)miR-204-5p/3p表達(dá)，分別抑制清道夫受體SR-A和CD36水平，達(dá)到防止泡沫細(xì)胞形成和冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制，該研究成果為深入開展冠狀動(dòng)脈硬化作用機(jī)制方面的研究，以及臨床上該疾病的防治提供了哪些指導(dǎo)意義？

梁老師：我們認(rèn)為從基礎(chǔ)研究角度來說，證明了NFATc3 / miR-204軸是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素。首次發(fā)現(xiàn)miR-204-3p特異性定位于巨噬細(xì)胞核中，通過抑制Ago2、H3K27ac和H3K4me3在CD36啟動(dòng)子上的富集從而抑制CD36的轉(zhuǎn)錄，與miRNA靶向目標(biāo)mRNA 3'-UTR經(jīng)典調(diào)控機(jī)制極為不同。臨床指導(dǎo)意義上，揭示了環(huán)孢霉素A等免疫抑制劑誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化副作用的分子機(jī)理。但是，需要注意的是，考慮到對(duì)于器官移植患者而言，直接干預(yù)NFAT可能會(huì)同時(shí)影響免疫抑制效應(yīng)，說明其下游關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子miR-204可能是免疫抑制劑動(dòng)脈粥樣硬化一個(gè)更為理想防治靶點(diǎn)，這也需要我們后續(xù)更深入的研究。

專家簡(jiǎn)介
梁思佳，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，副教授�，F(xiàn)任中國(guó)藥理學(xué)會(huì)心血管藥理專業(yè)委員會(huì)副秘書長(zhǎng)，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)心血管藥理青年委員會(huì)副主委，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)生化與分子藥理學(xué)青年委員會(huì)委員。致力于代謝性心血管疾病發(fā)病，特別是高脂血癥誘導(dǎo)心血管疾病致病機(jī)制研究。近年來以第一或通訊作者在Eur Heart J、Adv Sci、ATVB等SCI雜志發(fā)表論著12篇，其中6篇IF>10，2篇IF>30。主持國(guó)家自然科學(xué)基金3項(xiàng)；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利2項(xiàng)；參編教材2部。

俞曉峰，賽業(yè)生物中國(guó)區(qū)副總裁兼首席科學(xué)家。軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士，國(guó)際知名模式動(dòng)物和細(xì)胞生物學(xué)專家，耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院和紐約大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究員，美國(guó)基因打靶公司（iTL）和應(yīng)用干細(xì)胞公司（ASC）資深科學(xué)家。在基因修飾模式動(dòng)物領(lǐng)域有超過20多年研發(fā)與管理等方面的豐富經(jīng)驗(yàn)，在干細(xì)胞相關(guān)領(lǐng)域及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系基因改造研究也取得了巨大成就，其研究成果多次發(fā)表在 Nat Immunol、Hum Mol Genet、Mol Cell Biol 等高水平雜志上。