當(dāng)前位置 > 技術(shù)服務(wù) > 生物研發(fā)服務(wù)> 免疫與抗體 > 代測ELISA實(shí)驗(yàn) 酶聯(lián)免疫（ELISA）
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酶聯(lián)免疫（ELISA）
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ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體②酶標(biāo)記的抗原或抗體③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測方法。即：夾心ELISA、間接ELISA、競爭ELISA。
夾心ELISA
雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
加受檢標(biāo)本： 使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
加酶標(biāo)抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾心法測定標(biāo)本中的抗體。
間接ELISA
間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。
操作步驟如下：
將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)
加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。
加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體。
加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體測各種與抗原相應(yīng)的抗體。
競爭ELISA
競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌。
待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體之反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量，洗滌。
加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。
結(jié)果計(jì)算：
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖所示），按照檢測樣本的OD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出濃度值。
【ELISA標(biāo)本收集】
◇液體類標(biāo)本：
包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。
包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等。
◇血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇尿液：
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實(shí)行。
◇細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
檢測分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
◇組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
凡購買本公司目錄任何一種檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫、放射免疫），您只需將需要檢測的樣品和檢測指標(biāo)及標(biāo)本數(shù)量（48T/96T）告知我公司業(yè)務(wù)人員即可，免收檢測費(fèi)用。若客戶提供試劑盒，600元/盒。在接到客戶標(biāo)本當(dāng)日起，7個(gè)工作日內(nèi)將檢測報(bào)告送到客戶手中。外地客戶克郵寄樣品，郵寄方式請(qǐng)電話垂詢。
注意事項(xiàng)：
收集樣品前都必須有一個(gè)完整的計(jì)劃，必須確定被檢樣品的穩(wěn)定性。我們建議對(duì)樣品盡早進(jìn)行檢測，對(duì)取樣后當(dāng)天進(jìn)行檢測的樣品請(qǐng)及時(shí)儲(chǔ)存再4℃?zhèn)溆�。�?duì)需要周期取樣的樣品，請(qǐng)將樣品及時(shí)分裝后放在-20℃或-70℃條件下保存。因低溫和室溫直接影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，從而直接導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。待測放免樣品的客戶在取樣前須向我公司銷售人員索要說明書，具體操作注意事項(xiàng)請(qǐng)與我公司技術(shù)人員溝通
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