甲基化測序

 簡介

(1) 流水線式流程：多功能PyroMark Q24可與表觀遺傳學(xué)和基因分析流程無縫結(jié)合，且與QIAGEN先進的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化和PCR擴增技術(shù)相兼容；流水線式的流程意味著可更快速地獲得結(jié)果。

(2) 快速簡便：從PCR產(chǎn)物到單鏈樣品直接用于測序，應(yīng)用PyroMark Q24真空底座可在15分鐘內(nèi)同時制備24個樣品，使用該工作站操作簡單，且手動時間少于5分鐘。

(3) 自動化分析：PyroMark Q24軟件包含兩種分析模式：CpG和 AQ（等位基因定量分析）。這兩種模式可在同一個板上分析，支持同時分析不同類型的樣品。AQ模式可用于分析單個和多元位點以及二、三和四等位基因突變；CpG模式可用于分析多重連續(xù)CpG位點，提供亞硫酸氫鹽處理的內(nèi)參。

樣品要求：

1) 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)不小于1.6；260/230值不小于1.6；全基因組DNA無降解 
2) 樣品濃度：最低濃度不低于25ng/µl； 
3) 樣品總量：每個片段總量不少于500ng； 
4) 樣品溶劑：溶于純水或TE中； 
5) 樣品運輸：低溫運輸（-20℃）；且在運輸過程中請用parafilm將管口密封好，以防出現(xiàn)污染。

實驗內(nèi)容：

 基因組DNA首先經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理，序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）而甲基化的胞嘧啶保持不變。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化完成后，根據(jù)研究目的的不同可以選擇不同的DNA 甲基化檢測方法，明確是研究整體水平的甲基化還是特定位點的甲基化，或是要發(fā)現(xiàn)全基因組中新的甲基化位點，根據(jù)客觀條件篩選最靈敏、可靠、經(jīng)濟、簡便的方法進行分析。

    Pyrosequencing技術(shù)（圖2-38）通過檢測CpG對應(yīng)位點上C/T滲入的比例對目標(biāo)位點的甲基化程度進行定量分析，是目前最可靠的甲基化定量分析方法。該技術(shù)通過將鏈合成過程中釋放出的焦磷酸（PPi（轉(zhuǎn)化成光信號來監(jiān)測鏈的合成過程。測序引物可與PCR擴增的單鏈DNA模板雜交，與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶等酶以及底物，包括腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和熒光素一起孵育。與模板鏈互補的dNTP在DNA聚合酶的催化下結(jié)合到DNA鏈上，每次互補結(jié)合都會釋放與dNTP摩爾量相當(dāng)?shù)慕沽姿幔≒Pi）。存在APS的條件下ATP硫酸化酶將PPi轉(zhuǎn)化為ATP，ATP可驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素氧化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光。熒光素酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的可見光可用電荷耦合器檢測，可在原始數(shù)據(jù)輸出中看到一個峰值（Pyrogram）。每個峰的高度（光信號）與結(jié)合的核苷酸量成正比。三磷酸腺苷雙磷酸酶是一種核苷酸降解酶，可連續(xù)降解未結(jié)合的核苷酸與ATP。降解完成之后，結(jié)合另一個核苷酸。dNTP是依次添加的，反應(yīng)時Alfa-硫代三磷酸脫氧腺苷（dATPS）是dATP的替代物，因為DNA聚合酶對dATPS的催化效率比對dATP的催化效率高，且dATPS不是熒光素酶的底物。當(dāng)反應(yīng)繼續(xù)時，形成互補的DNA鏈，核苷酸序列由Pyrogram的信號峰值確定。