斑馬魚基因敲除服務(wù)

平臺服務(wù)描述

     基因敲除技術(shù)是人為地使靶基因的序列發(fā)生堿基對的增添、缺失或替換，引起的靶基因結(jié)構(gòu)的改變，以達(dá)到定點修飾改造特定基因的目的�；�因敲除技術(shù)是反向遺傳學(xué)研究中最重要的技術(shù)工具�；�因敲除斑馬魚廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境毒理學(xué)、水產(chǎn)育種學(xué)等研究領(lǐng)域。

     中心是我國唯一的國家級斑馬魚資源平臺，擁有規(guī)模最大和規(guī)格最高的單體斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)和一支高素質(zhì)的專業(yè)人才隊伍，保證以最高標(biāo)準(zhǔn)、最高質(zhì)量和最高效率完成相關(guān)技術(shù)服務(wù)。 

中心養(yǎng)殖系統(tǒng)

     目前，中心提供TALEN和gRNA-cas9技術(shù)介導(dǎo)的斑馬魚基因敲除技術(shù)服務(wù)。如您對條件性基因敲除（conditional knockout）或者基因精細(xì)修飾感興趣，也歡迎您與我們進(jìn)行詳細(xì)溝通。

1、TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）介導(dǎo)的敲除服務(wù)

     植物細(xì)菌Xanthomonas sp.的TAL蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其靶位點的核酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的。該技術(shù)首先需要構(gòu)建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點打斷目標(biāo)基因DNA，進(jìn)而在該位點進(jìn)行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或點突變。

     中心構(gòu)建了斑馬魚原始生殖細(xì)胞（PGC）高效、特異表達(dá)的TALEN平臺，相比常規(guī)的TALEN敲除平臺，可更加高效地篩選獲得TALEN敲除子代（特別是針對于效率較低的TALEN靶位而言）。

TALEN技術(shù)原理示意圖

2、gRNA-Cas9介導(dǎo)的敲除服務(wù)

     規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)（CRISPR）是一類廣泛分布于細(xì)菌基因組中的重復(fù)結(jié)構(gòu)，經(jīng)轉(zhuǎn)錄并加工成短的crRNA(CRISPR RNA)。crRNA通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合，形成雙鏈RNA，引導(dǎo)內(nèi)切酶Cas蛋白（CRISPR-associated protein）在crRNA序列靶標(biāo)的特定位點剪切雙鏈DNA。根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用原理，可利用其進(jìn)行真核生物基因組改造，即在靶標(biāo)DNA上實現(xiàn)特定位點的剪切，在剪切后的修復(fù)過程中會引入靶向DNA序列的突變。該技術(shù)中使用的gRNA（guide-RNA）是將crRNA和tracrRNA連接起來作為引導(dǎo)RNA，Cas9蛋白是type II CRISPR-Cas系統(tǒng)中的成員之一，具有HNH和RuvC-like兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域，分別剪切靶標(biāo)DNA的互補鏈和非互補鏈。

     中心構(gòu)建了斑馬魚原始生殖細(xì)胞（PGC）高效、特異表達(dá)斑馬魚偏好密碼子Cas9（zCas9）的CRISPR/Cas9敲除平臺，相比常規(guī)的Cas9敲除平臺，可更加高效地篩選獲得Cas9敲除子代（特別是針對于效率較低的Cas9靶位而言）；同時，中心也提供雙缺口（double nicking）的Cas9基因敲除服務(wù)，可以大大降低Cas9敲除的脫靶效應(yīng)。

gRNA-Cas9技術(shù)原理示意圖

特異、高效的斑馬魚PGC操作平臺

平臺服務(wù)內(nèi)容和流程

     目前我們提供AB背景的基因敲除斑馬魚制備，AB是最為普遍使用的標(biāo)準(zhǔn)純遺傳背景之一，直接保證了委托方得到純凈背景的基因敲除斑馬魚。同時根據(jù)委托方的需求，我們也提供TU以及其它遺傳背景的基因敲除制備。

1. 歡迎和我們就技術(shù)細(xì)節(jié)和具體需求進(jìn)行討論，雙方簽訂技術(shù)服務(wù)合同。

2. 平臺完成由雙方商議確定的技術(shù)進(jìn)行載體構(gòu)建。包括制備TALEN序列識別模塊（1周）或者合成gRNA（2-3天）。

3. 胚胎顯微注射及突變檢測。平臺向斑馬魚胚胎中注射TALEN mRNA或者gRNA-cas9 mRNA復(fù)合物。鑒定注射的胚胎群體是否產(chǎn)生靶向突變，如有，將P0代突變斑馬魚培養(yǎng)至性成熟（3月）。

4. 篩選出能傳遞目的基因敲除的P0代斑馬魚，與野生型斑馬魚雜交（或同一基因型P0代自交），建立F1代（5天）。

5. 將F1代突變斑馬魚培養(yǎng)至2月齡（能夠剪尾鰭進(jìn)行逐尾鑒定），鑒定目的基因成功敲除的F1代并刻畫敲除的基因型，交付委托方（2個月）。

服務(wù)承諾

    中心承諾在簽訂協(xié)議后140個工作日內(nèi)，針對每個靶基因提供至少5尾測序鑒定為突變的F1代突變斑馬魚；如果需要F2代突變體，則承諾每個靶基因提供至少10尾測序鑒定為突變的F2代個體。

典型的突變測序峰圖