病毒、微生物基因組測序

在新一代測序技術(shù)中，PacBio測序平臺往往因通量小和一直以來的關(guān)于準確率低的謠言而被忽視，但事實上，超長讀長、實時檢測堿基修飾、超高精度這三個特點正使得SMRT成為完成小基因組完整測序的最理想工具。    

在啟動大量經(jīng)費進行大規(guī)模測序時，理性地進行項目評估是必須要率先邁開的一步。如果對某個5.2 Mb炭疽基因組（B._anthracis Ames Ancestor）進行讀長評估的例子，同樣的覆蓋度下，100 bp（二代測序）讀長最終獲得98個Contig，1000 bp（三代測序）讀長最終獲得31個Contig，5000 bp讀長最終獲得1個Contig。基于短讀長和偏好擴增的二代技術(shù)實現(xiàn)的只能是大量的片段化組裝，要完成完整或精細組裝還需要額外的實驗操作和后續(xù)測序，總費用將非常昂貴。

Finished bacterial genomes from shotgun sequence data.和Reducing assembly complexity of microbial genomes with single-molecule sequencing. 兩篇文章中都提到了測序評估和成本比較，這個成本是在完成基因組完整測序的基礎(chǔ)上計算的，而且不再是以往的以$/Mb計算，因為深諳測序韜略的有識之士心里都清楚，單純的數(shù)字游戲是不能給項目成本預(yù)算提供任何實質(zhì)性幫助的。

美國國家生化防衛(wèi)分析與對策中心（NBACC）的Sergey Koren和Adam Phillippy以及美國農(nóng)業(yè)部（USDA）的Timothy Smith等人。他們?yōu)榱嗽u估測序項目，在數(shù)據(jù)庫中找了2267種已經(jīng)獲得完整基因組圖譜的微生物和古菌，并根據(jù)內(nèi)部重復(fù)序列的長度分成三類：第一類在數(shù)量上占69.07%，基本上只含有0.5-5 Kb長度的重復(fù)序列；第二類占7.59%，主要含5-7 Kb長度的重復(fù)序列；第三類占23.33%，含有7 Kb以上長度的重復(fù)序列。然后他們分別采用代表二代的500 bp讀長序列和代表三代的5000 bp讀長序列，通過軟件算法進行模擬拼接，主要評估讀長能否在全基因組范圍內(nèi)跨越所有的重復(fù)序列，以Gap數(shù)量作為最終評估指標，而覆蓋度方面，二代假設(shè)成無限程度覆蓋模式，三代僅用50-200X。最終的結(jié)果是：第一類中，以Bacillus anthracis Ames為例，三代方法能拼成完整圖，但二代方法還留有20個Gap；第二類中，以Yersinia pestis CO92為例，三代方法同樣能拼成完整圖，但二代方法還留有161個Gap；第三類中，以Escherichia coli O26:H11 11368為例，三代方法僅留有16個Gap，但二代方法還留有171個Gap�？紤]到以上只是軟件模型模擬出來的結(jié)果，他們還專門選擇了6個菌株分別在PacBio、454、MiSeq平臺上進行實際測序，最終驗證了這一模型的可靠性。且PacBio經(jīng)Quiver打磨后的精度達到并超過了99.99995%，而一般完成基因組完整圖的精度級別在99.999%，所以PacBio在精度上完全勝任。

那么后續(xù)的補洞費用到底有多高昂呢，或者說真正意義上獲得完成圖的總費用到底是多少呢？！直接綜合兩篇文章（Finished bacterial genomes from shotgun sequence data. Genome Res 2012, 22:2270-2277.和Reducing assembly complexity of microbial genomes with single-molecule sequencing. [http://arxiv.org/abs/1304.3752]）的分析，費用數(shù)據(jù)主要來自Duke大學(xué)和Illinois大學(xué)的實驗室和外部合作機構(gòu)，我們來看下總的結(jié)果。假如用Illumina平臺對5 Mb基因組進行測序，采用ALLPATHS組裝，之后預(yù)留50個Gap必須手工填補，總共需要花費$ 13,124。如果這些Gap后續(xù)用PacBio長片段測序去填補，成本直接縮小至$2,952。那么這個成本算是終極廉價了嗎？就怕你不敢想象！不要忘了，NGS測序容易引入系統(tǒng)誤差，尤其是早期NGS系統(tǒng)。既然如此，不如干脆忘掉早期NGS數(shù)據(jù)，推倒重來吧！假如換成PacBio從頭測序，用沒有升級的RS系統(tǒng)，一個SMRT Cell產(chǎn)出125 Mb數(shù)據(jù)量，那么一個5 Mb基因組需要花費6個SMRT Cell（100-150X），成本是$1,625，得到完整基因組圖譜。更進一步，假如換成升級后的RS II系統(tǒng)，用XL-C2試劑盒，一個SMRT Cell的通量大約500 Mb，僅用一個SMRT Cell就可以獲得100X覆蓋度，算上建庫、質(zhì)控、測序耗材總共花費為$ 636.96，得到的就是完整基因組圖譜，不需要后續(xù)補洞。文章作者沒有進一步計算，但考慮到PacBio在2013年Q4又推出了P5試劑盒，平均讀長達到了8500 bp，通量達到了0.8-1 Gb/SMRT Cell，如此一來，對一個5 Mb基因組進行從頭測序，僅需$400。$13,124+X（X為Illumina測序成本）對比$400。

因此，無論從項目評估和測序成本兩方面進行考量，三代測序技術(shù)都是最優(yōu)的，更何況還可以在測序同時實時檢測堿基修飾，這也無怪乎業(yè)界已經(jīng)將三代測序定義為微生物測序領(lǐng)域的金標準。評估考核還可以適當(dāng)引申到當(dāng)下炙手可熱的臨床樣本靶向測序領(lǐng)域，這需要從通量的角度上去做理性的選擇。比如在樣本數(shù)量不多的前提下，那么就完全可以選擇三代作為主導(dǎo)做單倍體分型、稀有突變鑒定、mRNA可變剪切、未知堿基修飾等精細分析，但如果樣本數(shù)動輒幾萬例，那么只能選擇高通量的二代作為主導(dǎo)做傳統(tǒng)的已知突變篩查等工作，此時三代可以在復(fù)雜基因分型場合作配合驗證。所以三代測序還有必要在通量上不斷尋求突破，就技術(shù)而言，這是它與二代相比的唯一弱點。