N端測(cè)序

——即蛋白質(zhì)N端氨基酸序列分析技術(shù)服務(wù)

“Edman降解，蛋白質(zhì)化學(xué)的經(jīng)典方法，氨基酸序列分析的金標(biāo)準(zhǔn)之一。”

Edman降解法是異硫氰酸苯酯（PITC）在弱堿（TMA）條件下與蛋白質(zhì)N端α-氨基偶聯(lián)生成苯氨基硫甲酰肽（PTC-蛋白質(zhì)），然后在無(wú)水強(qiáng)酸（TFA）條件下，N端的第一個(gè)殘基從完整的多肽、蛋白鏈上以2-苯氨基噻唑啉酮（ATZ-AA）的形式裂解下來(lái)，之后在稀酸（25% TFA）條件下，ATZ-AA轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的苯基乙內(nèi)酰硫脲衍生物，即PTH-氨基酸，生成的PTH-AA輸送至高效液相色譜中進(jìn)行在線(xiàn)分析，剩下的多肽蛋白樣品可反復(fù)進(jìn)行上述處理，依次生成各種PTH-AA，經(jīng)液相系統(tǒng)色譜柱分離可以確定被測(cè)多肽蛋白質(zhì)供試品N端的氨基酸排列順序。

 

技術(shù)流程

 

技術(shù)特點(diǎn)

•  
•   可靠性最高的測(cè)序方法

■  對(duì)蛋白質(zhì)多肽樣品的純度要求很高

■  非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸無(wú)法測(cè)定

分析應(yīng)用

“Edman降解法N端測(cè)序在未知蛋白的測(cè)序方面發(fā)揮不可替代的作用。”

蛋白質(zhì)的生物合成均起始于N端，其N(xiāo)端序列的組成對(duì)生物學(xué)功能有著巨大的影響，例如蛋白質(zhì)的半衰期、蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞器中的定位等等。并且N端可發(fā)生多種翻譯后修飾，這些也與蛋白質(zhì)的功能和穩(wěn)定性息息相關(guān)。因此，對(duì)于蛋白質(zhì)N端序列的分析，有利于幫助分析蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，揭示蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。并且隨著現(xiàn)代醫(yī)藥工業(yè)的發(fā)展，出現(xiàn)了大量的蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)藥物分子，對(duì)這些蛋白質(zhì)多肽類(lèi)藥物分子N端序列的分析確認(rèn)也是醫(yī)藥工業(yè)質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。

技術(shù)指標(biāo)

■  樣品要求：

     純度不低于95%；蛋白質(zhì)樣品N端未封閉；提供樣品的相對(duì)分子質(zhì)量；樣品含量不低于10 μg。

■  儀器設(shè)備：

           全自動(dòng)蛋白儀·多肽N端測(cè)序儀（SHIMADZU型號(hào)：PPSQ-33A）

■  分析軟件：

           PPSQ-30-Analysis、PPSQ-30-Data processing

           色譜柱（WAKO型號(hào)：Wakosil-PTH （4.6 mm*250 mm））

■  實(shí)驗(yàn)原理：

 

Edman降解法原理圖

案例分析

      案例一：抗體類(lèi)蛋白質(zhì)的輕重鏈分析和N端氨基酸序列測(cè)定

樣品名稱(chēng)：XXXXXXX理化測(cè)定對(duì)照品

批號(hào)：XXX-XXX-XXXX-X

樣品狀態(tài)：PVDF膜（抗體）

樣品重鏈理論序列為：NH2-X-X-X-X-X-X-X-X-X-X

譜圖結(jié)果：

 

     

案例二：未知序列蛋白質(zhì)類(lèi)樣品的N端氨基酸序列分析

樣品名稱(chēng)：未知

樣品狀態(tài)：PVDF膜

樣品理論序列：未知

譜圖結(jié)果：

Q&A

1)    N端測(cè)序儀的介紹。

多肽蛋白質(zhì)N端測(cè)序儀生產(chǎn)制造商主要有美國(guó)ABI公司和日本SHIMADZU公司。兩家公司的儀器均是基于Edman降解原理進(jìn)行N端測(cè)序，只是在后續(xù)的PTH-AA色譜分離條件方面存在差異。隨著后來(lái)ABI公司逐漸退出N端測(cè)序儀市場(chǎng)，相應(yīng)的儀器也已停產(chǎn)，使得SHIMADZU公司現(xiàn)在成為N端測(cè)序儀方面的主要制造商，其主要的N端測(cè)序儀型號(hào)為：PPSQ-33A、PPSQ-31A。

2)    Edman方法和質(zhì)譜方法的比較介紹。

Edman降解法和質(zhì)譜分析方法作為現(xiàn)有主要的蛋白質(zhì)樣品N端分析方法，有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)。Edman降解法作為現(xiàn)有蛋白質(zhì)樣品N端序列測(cè)試的黃金標(biāo)準(zhǔn)，已得到廣泛應(yīng)用，但還是存在不足之處，其通量較低，每個(gè)殘基測(cè)試需花費(fèi)45分鐘時(shí)間，且每個(gè)殘基測(cè)試的費(fèi)用成本較高，對(duì)于N端封閉的蛋白質(zhì)樣品無(wú)法直接進(jìn)行N端測(cè)序。

質(zhì)譜法分析作為蛋白質(zhì)樣品N端分析的另外一種手段，其通量高，成本相對(duì)較低，對(duì)N端封閉樣品可以進(jìn)行測(cè)試，但其對(duì)于未知序列的蛋白質(zhì)難以做出正確判斷，且無(wú)法區(qū)分分子量相近的氨基酸（I/L、Q/K），所以?xún)煞N方法蛋白質(zhì)樣品N端測(cè)序過(guò)程中可以相互進(jìn)行補(bǔ)充。

3)    N端氨基酸測(cè)序的樣品準(zhǔn)備過(guò)程。

PVDF膜蛋白質(zhì)樣品可直接進(jìn)行N端測(cè)序。N端測(cè)序?qū)�樣品純度要求較為嚴(yán)格，如果樣品純度低于95%需進(jìn)行電泳分離純化，之后電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上進(jìn)行N端測(cè)試。如果樣品純度高于95%，可進(jìn)行簡(jiǎn)單處理后進(jìn)行N端測(cè)試，處理過(guò)程為：液體樣品可直接通過(guò)prosorb轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，固體樣品用0.1% TFA溶液溶解后用相同方法亦轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，之后切取樣品膜進(jìn)行測(cè)試，如為小肽樣品或測(cè)試循環(huán)數(shù)較多（>20）需進(jìn)行樣品固定處理。