C端測序

——即質(zhì)譜法蛋白質(zhì)N/C端氨基酸序列分析技術(shù)服務(wù)

蛋白質(zhì)樣品的N/C末端序列分析，對于醫(yī)藥工業(yè)來說是非常重要的信息。目前N末端序列分析大多采取Edman降解法，但Edman降解法不能解決N端封閉和蛋白質(zhì)修飾的測序問題，而質(zhì)譜法測序則不受限制。蛋白質(zhì)的C末端分析，并不能采取類似N端氨基酸序列分析的化學(xué)分析。無論是國內(nèi)要求，還是國外藥典，現(xiàn)階段都是采取質(zhì)譜法對蛋白質(zhì)樣品的C末端序列分析。20世紀(jì)80年代末發(fā)展的基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）使質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析上的應(yīng)用發(fā)生了革命性飛躍。肽段在質(zhì)譜中的碎裂有一定規(guī)律，通常最容易斷裂的是肽鍵位置，得到分別命名為b離子和y離子的M/Z圖譜，分析圖譜得到蛋白質(zhì)的N/C端序列。

“Edman降解法并不能解決所有的蛋白質(zhì)氨基酸序列測定問題。”

電噴霧電離（ESI）質(zhì)譜可以對蛋白質(zhì)或者多肽樣品的N/C端氨基酸序列進行鑒定。APT為客戶進行N/C端氨基酸序列分析的儀器為LTQ-Velos，這是一種雙壓線性離子阱質(zhì)譜，在定量和定性分析方面都具有優(yōu)勢。由于高傳輸離子透鏡和快速掃描雙壓阱，LTQ-Velos顯著提高了碎裂能力，將碎裂時間縮短，同時提高質(zhì)譜分辨率。LTQ-Velos可以與液相色譜兼容，并同時快速分析大量蛋白質(zhì)成分。

技術(shù)指標(biāo)

■  蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜脫鹽及分離后用LTQ-Velos質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan, San Jose, CA）進行質(zhì)譜分析。

    進樣方式：Microspray；

    毛細(xì)管溫度：200℃；

    檢測方式：正離子；

    多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描（full scan）后采集20個碎片圖譜（MS2 scan）。

■  LTQ-Velos 產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)由Bioworks 3.3 軟件查庫，搜索使用的數(shù)據(jù)庫為根據(jù)樣品理論序列建立的蛋白庫，數(shù)據(jù)篩選參數(shù)為：Xcorr≥1.9 (Charge 1)， Xcorr≥2.2 (Charge 2)，Xcorr≥3.75 (Charge 3)。

案例分析

抗體類蛋白質(zhì)樣品的N/C端氨基酸序列分析

其中Trypsin酶解后的樣品經(jīng)過LC-MS/MS分析后，得到和理論C端序列（************）相符合的MS2圖譜，此MS2圖譜為2電荷離子，Xcorr得分為3.3，超過可信標(biāo)準(zhǔn)的要求（Xcorr≥2.2），圖譜如下：

質(zhì)譜法C端氨基酸序列測定的圖譜（實例），b、y離子匹配圖譜

Q&A

盡管Edman法技術(shù)已近乎完善，但仍有不盡人意之處，例如Edman降解法不能解決N端封閉的測序問題（環(huán)化、封閉）、被修飾的蛋白不能給出確切的信號，要求蛋白或多肽的純度在95%以上，靈敏度較低。質(zhì)譜法不受N末端封閉的限制，能對側(cè)鏈基團翻譯后加工或化學(xué)修飾進行定位，靈敏度很高，因而具有其獨特優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的Edman降解法相互補。

抗體類蛋白質(zhì)藥物分子重鏈C末端賴氨酸會有不同程度的缺失現(xiàn)象發(fā)生，質(zhì)量控制中需要建立對這類現(xiàn)象的定性和定量分析方法。C端賴氨酸（K）缺失后，會造成供試品酶解后C末端多肽分子的序列發(fā)生變化，并且這兩種C末端多肽分子（缺失或者不缺失K）的定量結(jié)果可以反映蛋白質(zhì)分子C端賴氨酸的缺失程度。

APT在合成供試品理論C端多肽分子和缺失賴氨酸C端多肽分子的基礎(chǔ)上，使用外標(biāo)法建立起對供試品C端賴氨酸缺失程度的定性定量方法。